馬 慧,沈永明,司 萍

(天津市兒童醫(yī)院 天津大學(xué)兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300134)

目前，感染性疾病仍然是全世界人類發(fā)病率和死亡率的主要原因。其致病原類型多樣，除常見(jiàn)病原體外，罕見(jiàn)細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲等病原體不易被檢測(cè)，給臨床診斷帶來(lái)困難。快速準(zhǔn)確地診斷病因病原體可能是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，因?yàn)楦鞣N各樣的微生物可能導(dǎo)致臨床上難以區(qū)分的疾病，而目前的方法可檢測(cè)病原體的光譜相對(duì)較窄。因此，由于病原體的多樣性，傳統(tǒng)檢測(cè)手段的局限性，以及臨床醫(yī)生對(duì)目標(biāo)病原體的判斷水平參差不齊，在臨床上超過(guò)2/3的感染性疾病最終仍無(wú)法鑒定其病原體，導(dǎo)致臨床不能針對(duì)性地用藥，經(jīng)驗(yàn)試錯(cuò)情況時(shí)有發(fā)生。這一困境在臨床重癥感染性疾病，特別是由疑難、罕見(jiàn)的病原體導(dǎo)致的臨床重癥型病例上尤其嚴(yán)峻[1-2]。

宏基因組二代測(cè)序(mNGS)是基于高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析對(duì)病原體進(jìn)行基因測(cè)序的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[3-4]，是一種不依賴于分離培養(yǎng)的新興病原體檢測(cè)技術(shù)。以其不需培養(yǎng)、鑒定速度快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)逐步應(yīng)用于感染性疾病領(lǐng)域。截至目前，該技術(shù)是臨床應(yīng)用最廣泛的病原體高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)臨床患者感染病原體的早發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療有著極其重要的作用。但就現(xiàn)階段而言，受限于高昂成本，mNGS 主要集中應(yīng)用于重大疾病、突發(fā)公共衛(wèi)生事件和特定病例人群，目前尚未納入常規(guī)臨床檢測(cè)[2]。本文就其在感染性疾病診斷中的應(yīng)用價(jià)值及其優(yōu)勢(shì)進(jìn)行綜述。

1 mNGS在不同器官系統(tǒng)感染性疾病中的應(yīng)用

1.1血流感染：血流感染(BSI)是危重患者常見(jiàn)的危及生命的并發(fā)癥，通常導(dǎo)致感染性休克和死亡。為了獲得最佳治療效果，目前的指南建議盡早開始廣譜抗菌治療，最好在敗血癥/感染性休克識(shí)別后1 h內(nèi)開始。然而在實(shí)際臨床實(shí)踐中，大約46%的經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療被證明是不合適的，導(dǎo)致死亡率增加35%，增加了抗生素耐藥性和毒性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)BSI病原體對(duì)于指導(dǎo)早期抗菌治療、實(shí)現(xiàn)更好的抗生素管理以及進(jìn)一步改善臨床結(jié)果非常有價(jià)值。目前，血培養(yǎng)結(jié)合抗菌藥物敏感性測(cè)試(AST)仍然是BSI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，血液培養(yǎng)受到周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)、敏感性相對(duì)較低的限制(因?yàn)橹笆褂每股貙?dǎo)致微生物接種量低或生長(zhǎng)抑制) ，以及低特異性。近年來(lái)，mNGS在疑似BSI患者的病原體檢測(cè)中顯示了巨大的潛力。mNGS不需要培養(yǎng)，可以分析臨床樣本中的整個(gè)微生物群落[5]。早期的研究已經(jīng)表明，mNGS與膿毒癥患者血液培養(yǎng)試驗(yàn)的診斷一致性高達(dá)93.7%，其結(jié)果與其他直接分子診斷方法的結(jié)果相當(dāng)或優(yōu)于，表明mNGS有可能識(shí)別多種感染，包括各種病因引起的血液感染[6]。mNGS的總體診斷敏感性明顯高于單獨(dú)使用的細(xì)菌培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)陰性膿毒癥病例提供了更好的結(jié)果。

綜上所述，在血液感染的診斷和治療指導(dǎo)方面，mNGS與基于培養(yǎng)的方法相比具有不可否認(rèn)的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)闊o(wú)論微生物類型如何，它都能將病原體鑒定所需的時(shí)間顯著縮短到24小時(shí)以下，且受抗生素影響較小[7]。

1.2中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染：各種病原微生物可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，表現(xiàn)為腦膜炎、腦炎和膿腫，通常威脅生命；早診斷、早治療是臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前臨床使用的主要病原學(xué)檢測(cè)方法靈敏度較低、時(shí)效性差，不能滿足臨床需要，導(dǎo)致患者無(wú)法得到早期診斷及精確用藥。因此，迫切需要及時(shí)準(zhǔn)確的診斷方法，近年來(lái)，mNGS顯示了其優(yōu)越性。近幾年應(yīng)用 mNGS從患者腦脊液中診斷出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏桿菌、李斯特菌、結(jié)核分支桿菌、福氏奈格菌、創(chuàng)傷弧菌、腦囊蟲相關(guān)的腦炎或者腦膜炎的案例相繼見(jiàn)諸報(bào)道[8]。還有報(bào)道稱從CNS感染疑診患者的腦組織中檢測(cè)出人類皰疹病毒和麻疹病毒[8]。mNGS輔助診斷CNS感染的作用越來(lái)越受到重視。此外，mNGS也被證明在診斷亞急性或慢性腦膜炎方面、在鑒定培養(yǎng)陰性和未診斷病例中存在的復(fù)雜和罕見(jiàn)病原體方面有價(jià)值。事實(shí)上，除了具有相當(dāng)高的診斷性能外，mNGS還可能有助于指導(dǎo)CNS感染的更具針對(duì)性的治療。然而，盡管與傳統(tǒng)方法相比，mNGS的總體檢出率更高，但它不能取代傳統(tǒng)方法，如培養(yǎng)。相反，建議將mNGS與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)結(jié)合使用，以提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病性診斷[9]。此外，在采集CNS樣本之前，mNGS結(jié)果受抗生素使用的影響較小，因此，在抗生素使用嚴(yán)重影響患者致病微生物檢測(cè)的情況下，該技術(shù)優(yōu)于其他方法。

1.3呼吸道感染：呼吸道感染目前仍是高發(fā)病率及高死亡率的疾病，其病原體的診斷非常重要，傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法診斷能力不足問(wèn)題日益突出。隨著mNGS的發(fā)展與成熟，該技術(shù)有望成為幫助指導(dǎo)靶向治療和抗生素合理應(yīng)用的有效工具。目前國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)于常見(jiàn)細(xì)菌診斷技術(shù)相對(duì)成熟,但對(duì)一些少見(jiàn)的細(xì)菌感染,比如結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、非結(jié)核分枝桿菌、各種放線菌、厭氧菌,診斷能力尚有不足[10]。mNGS可以相對(duì)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和識(shí)別多種病原體，有助于及時(shí)、準(zhǔn)確地治療肺部感染，特別是對(duì)危重病患者和混合感染患者。此外,使用mNGS也被證明可以提高肺部侵襲性真菌的診斷感染。此外，在免疫功能低下患者的分析中，mNGS的檢測(cè)準(zhǔn)確率甚至可能達(dá)到100%。mNGS目前是病毒發(fā)現(xiàn)的首選方法，特別是對(duì)于新出現(xiàn)的肺炎病毒(即SARS-CoV、MERS-CoV和H7N9)，并且可能有助于追蹤和控制疫情[11]。

1.4骨和關(guān)節(jié)感染(BJI)：骨關(guān)節(jié)感染在臨床上較為常見(jiàn)，尤其是骨科內(nèi)植物相關(guān)感染如假體周圍感染或骨折內(nèi)相關(guān)性感染是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)，盡管醫(yī)學(xué)水平不斷提高，但仍有許多骨關(guān)節(jié)感染患者最終因感染導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限、生活質(zhì)量下降和殘疾。目前傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)仍然是大多數(shù)醫(yī)院的主要診斷方法，但常規(guī)培養(yǎng)存在敏感度相對(duì)較低和費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，分子診斷已被應(yīng)用于BJI的診斷。這些技術(shù)獨(dú)立于培養(yǎng)的方法，目前PCR是一種普遍接受的病原體鑒定方法，敏感度有所提升，但無(wú)法識(shí)別真菌和多微生物混合感染。

滑液、外植體(即人工關(guān)節(jié)和其他矯形設(shè)備)的超聲液以及假體周圍組織均可通過(guò)mNGS來(lái)識(shí)別致病病原體。然而，迄今為止的研究主要集中在特定類型的樣品上，如超聲波液體或滑液。很少有隊(duì)列研究報(bào)告調(diào)查mNGS檢測(cè)BJI患者不同類型樣本病原體的能力。骨關(guān)節(jié)感染時(shí)，經(jīng)常無(wú)法獲得充分的關(guān)節(jié)液樣本，而組織樣本較容易獲取。常規(guī)的分子診斷手段多數(shù)需要采用關(guān)節(jié)液樣本提取病原體核酸以避免組織樣本中人員核酸污染的干擾，mNGS的技術(shù)特點(diǎn)無(wú)此方面限制[12]。另外， 國(guó)內(nèi)外一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)與常規(guī)培養(yǎng)相比，mNGS擁有更高的病原體檢出率，mNGS不僅可以檢測(cè)到所有常規(guī)培養(yǎng)陽(yáng)性病原體的序列數(shù)，還能從常規(guī)培養(yǎng)陰性的樣本中檢測(cè)到病原體序列數(shù)[13-14]。mNGS的另一優(yōu)勢(shì)是可以檢出混合感染，但也存在一定的局限性。其檢出的病原體無(wú)法確定是定植菌、背景菌或致病菌，對(duì)于病原體存活狀態(tài)也無(wú)法確定，還需要結(jié)合臨床表現(xiàn)和優(yōu)化培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行精準(zhǔn)診斷[12]。此外，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)骨關(guān)節(jié)感染的病原檢出率和報(bào)道近年逐漸增多。薛白等[13]報(bào)道在骨關(guān)節(jié)感染患者中，mNGS對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核而言，優(yōu)勢(shì)不明顯。其原因可能與送檢樣本的不同類型有關(guān)。為增加研究結(jié)果的可靠性，未來(lái)應(yīng)持續(xù)開展大樣本的、多中心的研究。

綜上所述，對(duì)于培養(yǎng)陰性BJI、通過(guò)關(guān)節(jié)腔穿刺獲得的樣本量有限或患者對(duì)經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療或清創(chuàng)反應(yīng)不佳的情況，應(yīng)強(qiáng)烈建議使用mNGS[15]。

1.5尿路感染(UTI)：UTI是一種常見(jiàn)的社區(qū)獲得性感染，通常由細(xì)菌以及某些真菌或病毒引起。大腸桿菌(≈75%)是簡(jiǎn)單和復(fù)雜UTI最常見(jiàn)的病原體，后者由復(fù)雜的致病微生物組成，這使得診斷病原體相當(dāng)困難?？股刂委熗ǔＪ荱TI患者的優(yōu)先治療策略，然而，由于最近嚴(yán)重的抗生素濫用，病原體對(duì)抗生素的耐藥性顯著增加，進(jìn)一步增加了疾病負(fù)擔(dān)[16]。因此，快速、準(zhǔn)確地鑒定UTI的病原體，進(jìn)而優(yōu)化藥物治療至關(guān)重要。UTI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是定量尿培養(yǎng)。然而，細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室定量尿液培養(yǎng)通常至少需要18 h，這表明發(fā)病后24～48 h內(nèi)診斷可能存在困難[17]。此外，由于許多病毒和寄生蟲傳統(tǒng)上難以培養(yǎng)或不可能培養(yǎng)，因此可以通過(guò)檢測(cè)特定抗原、抗體或基因的血清學(xué)和分子方法進(jìn)行診斷。然而，臨床醫(yī)生的事先判斷對(duì)于診斷仍然是重要和必要的[18]。mNGS能夠比培養(yǎng)方法更快、更敏感地識(shí)別病原體，無(wú)需臨床前預(yù)測(cè)或培養(yǎng)，這進(jìn)一步促進(jìn)了準(zhǔn)確診斷和最佳治療。

1.6消化系統(tǒng)感染：主要的腸道病原菌種類包括來(lái)自外部環(huán)境的侵入性腸道病原菌和來(lái)自共生腸道的病原菌。由于腸道通常由共生細(xì)菌定植，糞便樣本的mNGS主要集中在非細(xì)菌物種，例如輪狀病毒A、隱孢子蟲和人類帕雷喬病毒，這些病毒通常在發(fā)熱兒童的糞便樣本中檢測(cè)到。mNGS也被用于檢測(cè)急性膽囊炎患者的潛在病原體，篩查是否存在罕見(jiàn)病毒，或識(shí)別急性肝衰竭患者的合并感染。除了病原體識(shí)別外，mNGS也是一種快速和不可知的診斷方法，用于研究耐藥體，并可用于識(shí)別腸道中的抗生素耐藥基因(ARG)，幫助檢測(cè)多藥耐藥菌(MDROs)，從而導(dǎo)致早期實(shí)施感染預(yù)防實(shí)踐、抗菌優(yōu)化和預(yù)防侵襲性感染[19]。

2 總結(jié)

mNGS不僅可以快速檢測(cè)和全面識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體和鉤端螺旋體等，而無(wú)需事先推定致病者。而且病原體可以直接從各種臨床標(biāo)本(血液、痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、胸水、腹水、膿液和組織標(biāo)本)中識(shí)別，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，優(yōu)于基于培養(yǎng)的方法，尤其是對(duì)于分枝桿菌、厭氧菌、非典型病原體和病毒。此外，mNGS受先前抗生素暴露的影響較小[9]。因此，mNGS在傳染病診斷和鑒別診斷方面顯示出巨大潛力。但目前該技術(shù)只能檢測(cè)到細(xì)菌屬水平，不能檢測(cè)到種水平及提供相應(yīng)的細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)。檢出的病原體尚無(wú)法判斷是否為致病菌及是否存活。希望在未來(lái)的研究中能夠解決這個(gè)問(wèn)題。