蔣孫班,康思思,趙利娜,王 朝,蔣麗娜

（1.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫教研室，河北 張家口 075000；2.河北省張家口市第二醫(yī)院患者回訪中心，河北 張家口 075000）

Toll樣受 體（Toll-like receptors，TLRs）是模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）的一種，由其家族成員內(nèi)一系列蛋白分子組成，通過識別微生物共有的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）傳遞的信號，進(jìn)而通過通路下游一系列分子激活先天免疫和適應(yīng)性免疫，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。TLR的Cross-talk主要通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，My D88）和含TIR結(jié)構(gòu)域的配體誘導(dǎo)β干擾素（TIR-domain-containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）及其下游通路分子誘導(dǎo)，并在維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮相應(yīng)功能［1］。研究［2-4］顯示：TLRs與免疫細(xì)胞中存在的其他PRR（包括其他TLRs）、免疫分子和蛋白酶類之間存在Crosstalk，并在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TAN等［5］對TLRs及其Cross-talk在增加機(jī)體先天免疫的特異性中的作用進(jìn)行了總結(jié)，認(rèn)為TLRs的Cross-talk在自身免疫和免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。本文作者結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)研究，對TLRs信號通路及TLRs的Cross-talk在各種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行綜述。

1 TLRs及其信號通路

TLRs廣泛分布于上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面，分布于免疫器官和心、腦、肺、肝及腎等臟器組織中［6］，多與宿主防御功能有關(guān)［7］。TLRs是由細(xì)胞內(nèi)Toll-白細(xì)胞介素1受體（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）、胞外富含亮氨酸的重復(fù)性單位（leucinerich repeat，LRR）和跨膜區(qū)三部分構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白組成，其胞外結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)PAMPs分子的識別［8］，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w的識別信號向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)［9-10］。細(xì)胞中定位合適的TLRs對于其配體親和性及TLRs自身結(jié)構(gòu)的維持和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活至關(guān)重要。TLRs信號通路在調(diào)控免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用［11］。TLRs信號通路中MyD88是介導(dǎo)信號通路和先天免疫反應(yīng)信號途徑中重要的關(guān)鍵接頭分子，也是機(jī)體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)蛋白。MyD88通過調(diào)控信號傳導(dǎo)途徑可實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能［12］，MyD88的缺失可導(dǎo)致下游免疫相關(guān)信號的活化和失活及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中斷，其也參與活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號級聯(lián)放大反應(yīng)［13］。TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過My D88、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB的激活發(fā)揮功能［14］。因此，根據(jù)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是否有My D88的參與，將TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為依賴MyD88的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和不依賴MyD88的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15-16］。而在2條通路的下游信號分子中，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（tumor necrosis factor receptor associated factors 3，TRAF3）和腫瘤壞死因子受體作用因子6（TNF receptor associated factors 6，TRAF6）是關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)。

1.1 MyD88依賴信號通路MyD88具有N端的死亡結(jié)構(gòu)域和C端的TIR結(jié)構(gòu)域［17］。在依賴MyD88的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，C端的TIR結(jié)構(gòu)域和TLRs的TIR相互結(jié)合，N端死亡結(jié)構(gòu)域和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶 （interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，MyD88募集IRAK結(jié)合，募集的IRAK自身磷化后脫離MyD88，與作為重要節(jié)點(diǎn)的TRAF6結(jié)合后，分化出NF-κB和JAK/APK 2條不同的信號傳導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）和MAPK激酶6（MAP kinase kinase 6，MKK 6）的活化后轉(zhuǎn)位而激活下游的NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和MAPK的p38信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）和腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）等促炎細(xì)胞因子的分泌，自然殺傷細(xì)胞達(dá)到炎癥的部位，進(jìn)行消滅病原體，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［18］。

1.2 My D88非依賴性信號通路MyD88缺失TLR4不缺失的小鼠樹突狀細(xì)胞仍可成熟。研究［15，19-20］顯示：MyD88存在同源蛋白，也證實(shí)了MyD88非依賴信號通路的存在；同時其也被稱為TRIF依賴途徑，在TLRs家族中只存在于TLR3和TLR4的下游通路［21］。TRIF分別與TRAF6和TRAF3相互作用并招募下游分子，最終在細(xì)胞核中共同作用于NF-κB活化過程。研究［22］顯示：該信號通路中LPS刺激可導(dǎo)致TRAF3招募的干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的活化，進(jìn)而對下游信號進(jìn)行調(diào)節(jié)。MyD88同源蛋白有TIR結(jié)構(gòu)域的連接蛋白（MyD88轉(zhuǎn)接樣蛋白，包括TIRAP和MAL），在TRIF依賴信號通路中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究［23］顯示：另一種含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白1（TIR domain containing adapter molecule-1，TICAM-1）可誘導(dǎo)產(chǎn)生IRF3，IRF3由羧基末端的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化協(xié)同調(diào)控完成轉(zhuǎn)錄的活性，病毒在自我復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA被TLR3識別活化TRAF6下游的TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK 1），使IRF3羧基末端的絲氨酸殘基磷酸化，使其從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，磷酸化的IRF3和干擾素刺激的反應(yīng)成分ISRES共同作用，誘導(dǎo)靶基因IFN和ISG56的激活及轉(zhuǎn)錄?？梢娫贛yD88依賴信號通路和TRIF依賴途徑中，TRAF3或TRAF6均作為重要的分子，使上游信號向不同方向正確傳遞。

2 TLRs的Cross-talk

TLRs通過結(jié)合入侵的病原體，并激發(fā)下游信號通路而在機(jī)體免疫中起關(guān)鍵作用，但TLRs受體本身無法完全賦予炎癥屬性和特征。反之，在炎癥發(fā)展進(jìn)程中，TLRs與不同的細(xì)胞內(nèi)外信號分子結(jié)合并與其他調(diào)節(jié)途徑發(fā)生Cross-talk的能力是決定炎癥反應(yīng)的類型、強(qiáng)度和持續(xù)時間的重要因素［24］。已有研究［24-27］顯示：Fc受體（Fc receptor，F(xiàn)cR）、補(bǔ)體（complement，C）、PRR和一些信號分子通過與TLRs的Cross-talk調(diào)節(jié)，在細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子與炎癥進(jìn)程等過程中起重要作用。一方面，上述分子被上游的病原體激活后，進(jìn)而激活其下游的信號分子通路，通過與活化的TLRs下游通路產(chǎn)生協(xié)同作用或在某一水平上匯合，促進(jìn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等細(xì)胞因子的釋放，以加強(qiáng)免疫應(yīng)答，促進(jìn)T輔助細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換和減少病原體的免疫逃逸。另一方面，為防止炎癥相關(guān)通路的過度激活或體內(nèi)出現(xiàn)免疫抑制的微環(huán)境，某些信號分子會作為TLRs通路的抑制分子，通過下調(diào)TLRs的表達(dá)，干擾TLRs與配體的識別和抑制TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來降低免疫應(yīng)答。不過，這種Cross-talk作用具有兩面性，功能正常時其在宿主的免疫防御中起重要作用，而在其功能紊亂時可能引發(fā)針對機(jī)體自身抗原的免疫應(yīng)答、炎癥失控甚至休克。

3 TLRs的Cross-talk與炎癥性疾病

3.1 TLRs的Cross-talk與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）SLE的病因及其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，研究者［28］認(rèn)為：SLE發(fā)病的主要原因?yàn)檫z傳與環(huán)境因素相互作用引起機(jī)體免疫功能紊亂，病原微生物感染人體誘導(dǎo)疾病發(fā)生。TLRs在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的外周血單個核細(xì)胞中可被外源性的病原體和內(nèi)源性的損害分子激活，導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）轉(zhuǎn)入細(xì)胞核激活炎性細(xì)胞因子和趨化因子，使其在自身免疫性疾病中表達(dá)上調(diào)［29-30］。

已有研究［31］顯示：許多細(xì)胞因子在SLE的發(fā)病過程中起重要作用，其中B細(xì)胞活化因子（B cell-activating factor，BAFF）被認(rèn)為是其中具有代表性的細(xì)胞因子。同時，超過一半的活動性SLE患者在基因表達(dá)分析［32］結(jié)果中顯示具有Ⅰ型干擾素明顯升高的特點(diǎn)。而缺乏Ⅰ型干擾素受體的基因修飾小鼠的特征為對狼瘡樣疾病有高度抗性。SLE的特征之一為B細(xì)胞反應(yīng)過度，而Ⅰ型干擾素是TLRs通路的下游產(chǎn)物，提示TLRs信號通路可能與B細(xì)胞的激活過程發(fā)生協(xié)同，通過降低B細(xì)胞反應(yīng)的閾值增加B細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度。研究［33］顯示：B細(xì)胞中的BAFF通過結(jié)合跨膜激活物、鈣調(diào)節(jié)物、親環(huán)蛋白配體相互作用物（transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI），一種對于BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠中類別轉(zhuǎn)換自身抗體的產(chǎn)生至關(guān)重要的受體，與TLR7下游中的MyD88通路發(fā)生協(xié)同，促進(jìn)未成熟B細(xì)胞的類別轉(zhuǎn)換和自身抗體的產(chǎn)生。抑制TLR7信號通路對TACI的影響有限，但足以減少自生抗體的產(chǎn)生。除此之外，漿細(xì)胞中TLR7信號通路也產(chǎn)生了類似效應(yīng)。TLR7的功能增強(qiáng)可以引起生發(fā)中心（germ center，GC）自發(fā)形成和濾泡外體細(xì)胞高頻突變，促進(jìn)漿細(xì)胞分化，使自身免疫表型增加［34］。有研究［35］顯示：對于維持GC結(jié)構(gòu)至關(guān)重要的濾泡樹突狀細(xì)胞，在特異性狼瘡中連接補(bǔ)體受體CD21結(jié)合補(bǔ)體形成自身免疫復(fù)合物后，通過TLR7途徑表達(dá)Ⅰ型干擾素。該途徑對于自發(fā)GC的形成和同型轉(zhuǎn)換自身抗體的產(chǎn)生很重要。此外，TLR7和TLR9的Cross-talk在SLE的發(fā)病過程中起重要作用。UNC93B1蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種蛋白，NC93B1蛋白中不同的氨基酸與TLR7和TLR9結(jié)合，帶有N端D34A突變的UNC93B1與TLR9正常相互作用，但與TLR7的相互作用較野生型UNC93B1強(qiáng)。增強(qiáng)的UNC93B1-TLR7結(jié)合增加了TLR7由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向內(nèi)體的信號輸出。這使得TLR9和TLR7在刺激抗體產(chǎn)生的過程中起相反的作用，即前者抑制了后者的促進(jìn)作用［36］。TLRs作為模式識別受體之一，參與了B細(xì)胞相關(guān)的SLE的發(fā)病過程，但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 TLRs的Cross-talk與急性肺損傷（acute lung injury，ALI）鑒于多種炎性介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞共同參與ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病理生理機(jī)制，已有越來越多的研究闡述TLR-TLR的Cross-talk在ALI發(fā)展中的作用。創(chuàng)傷患者出現(xiàn)ALI后，肺中的多形核中性粒細(xì)胞 （polymorphonuclear neutrophil，PMN）在內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）和巨噬細(xì)胞的參與下，經(jīng)過一系列細(xì)胞事件后發(fā)生遷移，因其參與炎癥的放大效應(yīng)而作為ALI的 關(guān) 鍵 事 件［37］。研 究［38］顯 示：PMN介 導(dǎo) 的TLR4-TLR2串?dāng)_的擴(kuò)增加劇了炎癥的程度。PMN中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）通過促進(jìn)p47蛋白磷酸化和P47-GP91的組合，從而裝配完整的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶是一種高度可調(diào)節(jié)的膜結(jié)合酶復(fù)合物，其利用NAD（P）H作為電子供體，通過單電子還原氧來催化超氧化物的產(chǎn)生。核心酶由膜結(jié)合的蛋白（即gp91和p22）和胞質(zhì)內(nèi)蛋白（即p40、p47、p67和rac-1/2）組成［39］。NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧作為氧化劑，參與TLR下游的NFκB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的增強(qiáng)。研究［37］顯示：白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptorassociated kinase 4，IRAK4）（在TLR激活后，MyD88依賴性途徑的下游成分）是ALI患者TLR2被氧化劑活化增強(qiáng)的作用靶點(diǎn)。氧化劑本身雖無法直接激活I(lǐng)RAK4，但可以放大脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的IRAK4激活。故IRAK 4可能是負(fù)責(zé)TLR4-MyD88信號傳導(dǎo)的重要氧化還原調(diào)節(jié)激酶。還有研究［40］顯示：HMGB1通過激活經(jīng)典巨噬細(xì)胞（M 1）中的雙鏈RNA活化蛋白激酶（double-stranded RNAactivated protein kinase，PKR）并通過TLR2和TLR4的Cross-talk介導(dǎo)的NF-κB信號通路誘導(dǎo)M 1極化，從而參與小鼠LPS誘導(dǎo)的ALI過程?？梢奌MGB1充當(dāng)炎癥的早期介質(zhì)，通過TLR4-TLR2的Cross-talk導(dǎo)致出血后ALI的發(fā)展。有研究［41］顯示：肺巨噬細(xì)胞（pulmonary macrophage，PM）中，TLR4-TLR3的Cross-talk亦會加重肺損傷，表明LPS通過TLR4-MyD88-NF-κB信號上調(diào)PM中TLR3的表達(dá)，而增加的TLR3導(dǎo)致MIP-2表達(dá)增強(qiáng)。MIP-2作為PM分泌的趨化因子，在PMN的遷移過程中起重要決定作用。除此之外，TLR3表達(dá)升高也增加了TNF和IL等炎性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而促進(jìn)PMN遷移，最終導(dǎo)致ALI。由此可見，TLR-TLR的協(xié)同放大可能是有害的，因其可能導(dǎo)致免疫過度激活，從而阻礙免疫穩(wěn)態(tài)。因此，深入了解TLRs協(xié)同放大的機(jī)制可能有助于設(shè)計(jì)新的治療策略，為預(yù)防和治療嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)提供依據(jù)。

3.3 TLRs的Cross-talk與膿毒癥TLR4作為最主要的TLRs之一，在膿毒癥的發(fā)病過程中起重要作用。IL家族分子與TLR4介導(dǎo)的敗血癥相關(guān)。有研究［42］顯示：JAK/STAT和TLRs通路的Crosstalk是調(diào)節(jié)宿主全身炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。經(jīng)由STAT 3的IL-6反信號通路激活以LPS為配體的TLR4及其下游通路，并反饋到MyD88/NF-κB途徑中，從而驅(qū)動TLR4/LPS產(chǎn)生更多的IL-6，加重炎癥。IL-6是重要的炎性細(xì)胞因子之一，IL-6通過與膜結(jié)合并相互作用，由酶水解產(chǎn)生天然可溶性白細(xì)胞介素6Ra（soluble interleukin-6Ra，sIL-6Ra），之后進(jìn)行“反式傳遞”信號于gp130受體亞基，由gp130激活STAT 3，進(jìn)一步正向調(diào)節(jié)MyD88而非TRIF通路，使小鼠對LPS的超敏反應(yīng)加劇，加速膿毒癥病理進(jìn)程。還有研究［43］顯示：依賴于IL-17受體的Sef/IL-17R（SEFIR）結(jié)構(gòu)域與TLR的TIR結(jié)構(gòu)域（構(gòu)成STIR結(jié)構(gòu)域超家族）在長度和二級結(jié)構(gòu)上具有相似性，IL-17RD的SEFIR結(jié)構(gòu)域可靶向抑制TIR適配器：MyD88、Mal、TRIF和TRAM，減少促炎因子的表達(dá)。另外，TLR4與補(bǔ)體的Cross-talk可引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致膿毒癥，其中補(bǔ)體C5和CD14的Cross-talk已被深入研究。CD14是一種結(jié)合蛋白，可促進(jìn)LPS從LPS結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)移至TLR4-MD2復(fù)合物中，從而提高細(xì)胞對LPS的敏感性。研究［44］顯示：補(bǔ)體C5和TLR受體CD14的雙重阻斷，可能通過抑制C5a介導(dǎo)的TLR4下游MAPKs和JNK通路，最終提升實(shí)驗(yàn)性敗血癥者的存活率。不過，TLRs與其他模式識別受體的Cross-talk可能有利于改善膿毒癥患者的癥狀。研究［45］顯示：清道夫受體（scavenger receptor，SR）通過抑制TLR4下游通路TRAF6的泛素化，減少NF-κB的激活及其隨后產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)。TLR和核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLR）信號之間的Crosstalk導(dǎo)致TNF-α和IL-6啟動子的NF-κB增強(qiáng)激活，增強(qiáng)炎癥性細(xì)胞因子的分泌并加速細(xì)菌清除，從而預(yù)防多發(fā)性膿毒癥［46］。有研究［47］顯示：一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)劑，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3，Tim-3）通過促進(jìn)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化和A 20活性來抑制LPS-TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化，以抑制巨噬細(xì)胞的過度激活和引導(dǎo)內(nèi)毒素耐受。A 20是一種維持內(nèi)毒素耐受增加的鋅指蛋白，而PI3K-AKT是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的關(guān)鍵途徑。鑒于不受控制的巨噬細(xì)胞活化可能導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)和敗血癥患者存活率降低，盡管其具體機(jī)制尚不清楚，但Tim-3的免疫抑制作用可視為敗血癥患者的一種新的適應(yīng)性補(bǔ)償和保護(hù)機(jī)制。研究［48］顯示：肺泡上皮細(xì)胞中TLR2與TLR4的Cross-talk既加重?cái)⊙Y，又引發(fā)ALI。可見TLR2與TLR4協(xié)同作用對炎癥疾病進(jìn)程具有重要影響。

4 小結(jié)和展望

TLRs的Cross-talk作為先天性免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在病原體被模式識別受體識別加工后產(chǎn)生的病理生理學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLRs的Cross-talk類型眾多，在各種炎癥性疾病中產(chǎn)生包括細(xì)胞凋亡、免疫抑制和免疫過激等多方面的效應(yīng)，這種效應(yīng)在宿主中普遍存在，只是作用強(qiáng)弱不等。盡管已發(fā)現(xiàn)眾多TLRs的Cross-talk組成、功能和信號通路，但同一分子基礎(chǔ)和功能的TLRs的Cross-talk產(chǎn)生的不同生物化學(xué)變化及這種變化如何調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)值得進(jìn)一步研究。另有研究［47］顯示：免疫抑制劑在抑制TLRs的Cross-talk引發(fā)的過度免疫應(yīng)答過程中起重要作用，可作為今后研究的重點(diǎn)。

綜上所述，以TLRs的Cross-talk作為研究靶點(diǎn)，研究其在炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，可為相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。