聶晨晨, 袁 潔, 凡勇福, 阮曉迪綜述, 蘇凱奇, 馮曉東,2審校

缺血性腦卒中是全球最常見的死亡與致殘?jiān)?占所有卒中的75%～80%[1]。嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。組織型纖溶酶原激活目前雖作為腦缺血損傷公認(rèn)且有效的治療手段,但其具有治療時(shí)間窗短、再通率低等弊端。中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞,在腦缺血損傷早期,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞起吞噬碎片作用；隨著炎癥反應(yīng)及炎性細(xì)胞的進(jìn)一步釋放,其被過度激活,進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)的發(fā)生,引起腦缺血后神經(jīng)元的損傷、加劇血腦屏障破壞和腦水腫。有研究表明[2]小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)腦缺血損傷的炎癥反應(yīng)與M1與M2表型極化有關(guān)。目前,關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞表型改變的分子機(jī)制尚未明確,現(xiàn)有大量研究證實(shí)[3,4]microRNA(miRNA)可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、表型轉(zhuǎn)化及炎癥因子的表達(dá)。本文將從miRNA調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活及表型轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行介紹,旨在為腦缺血臨床治療開拓新視角。

1 小膠質(zhì)細(xì)胞激活與雙重作用

19世紀(jì)末小膠質(zhì)細(xì)胞被稱為桿狀細(xì)胞,起源于卵黃囊原始巨噬細(xì)胞,其更新依賴于自身增殖與凋亡的偶聯(lián)過程,含量約占大腦組織的10%[5],多分布在灰質(zhì)、海馬體、基底節(jié)和嗅皮質(zhì)中,是唯一一個(gè)永久駐留于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血、缺氧環(huán)境下快速激活,激活后在釋放嗜神經(jīng)因子、吞噬有害物質(zhì)的同時(shí)誘導(dǎo)大量促炎因子的釋放。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用取決于小膠質(zhì)細(xì)胞中M2表型的極化。Choi等[6]研究發(fā)現(xiàn)M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基導(dǎo)致缺血性腦卒中后同側(cè)SVZ(側(cè)腦室)中NSPCs(神經(jīng)干細(xì)胞)的增殖與分化。在缺血損傷腦內(nèi)早期注射小膠質(zhì)細(xì)胞有助于M2型小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)抗炎作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的M1和M2不同表型之間動(dòng)態(tài)變化,對(duì)于腦組織損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)起著重要的作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血時(shí)的損害作用與其過度激活、M1表型極化有關(guān)。在腦缺血損傷中,過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞已被證明參與多種疾病中神經(jīng)炎癥的表達(dá)[7]。研究結(jié)果顯示[8]通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),增加Bcl-2的表達(dá)數(shù)量,可提高細(xì)胞存活率。Yang等人發(fā)現(xiàn)[9]黃芩素通過降低JNK、ERK、p38的磷酸化水平、抑制NF-κB信號(hào)通路、降低炎性因子IL-6的釋放,促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型的轉(zhuǎn)化,有利于降低炎癥反應(yīng)。此外還可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型的表達(dá),促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的磷酸化,抑制細(xì)胞自噬。由此可見小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可促使細(xì)胞自噬、神經(jīng)元凋亡。一項(xiàng)研究使用[10]時(shí)移雙光子成像技術(shù)對(duì)MOCA大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),其結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的增多伴隨著血管生成的減少。在腦卒中早期,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,將有助于維持血腦屏障的完整性,其機(jī)制涉及炎癥遞質(zhì)釋放及相關(guān)通路的激活、細(xì)胞間的相互作用與氧化應(yīng)激。以上結(jié)果均表明抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活及M1表型的轉(zhuǎn)化有望成為腦缺血損傷治療的有效靶點(diǎn)。

總之,及時(shí)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型表達(dá)可作為腦缺血損傷治療的有效手段。此外,不同表型的極化在腦缺血損傷中具有時(shí)空分布特性。在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期給予干預(yù)有助于最大程度發(fā)揮小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用。

2 miRNA調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血損傷中的作用

MicroRNA作為一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過誘導(dǎo)Dicer復(fù)合體降解mRNA或抑制mRNA的表達(dá),從而影響某些轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子的表達(dá)[11]。在一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)[12]中采用miRNA高通量技術(shù)可觀察到腦缺血環(huán)境下miRNA的變化,但是miRNA是否能夠成為腦缺血后診斷與治療的重要靶點(diǎn)一直是研究熱點(diǎn)。依據(jù)miRNA在小膠質(zhì)細(xì)胞中的具體作用,將miRNA分為:促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活及M1型轉(zhuǎn)化與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及M2型轉(zhuǎn)化兩種。

2.1 正向調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活與促使M1轉(zhuǎn)化

2.1.1 miRNA let-7c-5p miRNA let-7c-5p作為人體最為豐富的miRNA,可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡參與疾病的病理過程,Jingshu Ni等人[13]發(fā)現(xiàn)在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以及脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中miRNA let-7c-5p的含量下降,提示活化的小膠質(zhì)細(xì)胞伴隨著Let-7c-5p的含量減少。該研究與MCAO小鼠體內(nèi)Let-7c-5p的變化一致。當(dāng)MCAO小鼠腦內(nèi)過表達(dá)let-7c-5p時(shí),腦梗死損傷體積減少,有利于腦缺血損傷的恢復(fù)。由此可見miRNA let-7c-5p可作為腦缺血損傷的治療靶點(diǎn),其機(jī)制為miRNA Let-7c-5p靶向結(jié)合在凋亡蛋白caspase 3 mRNA的3’-未翻譯區(qū)抑制其表達(dá),維持小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)。

2.1.2 MiRNA-200b 缺血性腦梗死若不及時(shí)治療容易誘發(fā)腦水腫,不利于患者日后恢復(fù)。而大腦神經(jīng)炎癥因子的釋放是缺血后腦水腫發(fā)生的重要機(jī)制。已有研究表明miRNA-200b的表達(dá)與腦缺血損傷密切相關(guān),其高度上調(diào)可促進(jìn)相關(guān)神經(jīng)炎癥因子釋放。Wen等人[14]證實(shí)這一結(jié)論,在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中,注射高滲鹽水能夠通過抑制miR-200b的表達(dá)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型極化及減弱TNF-α、IL-1β及小膠質(zhì)細(xì)胞M1標(biāo)記物(iNOS、CD86)和miR-200b的表達(dá)。隨后的熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)為miRNA-200b在腦缺血損傷小膠質(zhì)細(xì)胞作用中的靶基因。KLF4可在抑制NF-κB活化因子同時(shí)與Arg1、Stat6結(jié)合,誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型基因程序[15]。

2.1.3 miR-377 已有研究表明miR-377可成為腦缺血損傷的治療靶點(diǎn)。Fan Y等人[16]發(fā)現(xiàn)在腦缺血損傷大鼠側(cè)腦室內(nèi)注射miR-377抑制劑,能夠減少氧剝奪模型(OGD)下小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及相關(guān)促炎因子的釋放,并且促使血管生成相關(guān)細(xì)胞的增殖與遷移。隨后他們應(yīng)用miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)分析證實(shí)ERG2、VEGF可作為miR-377的作用靶點(diǎn),miR-377與EGR2、VEGF的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。EGR2[17]通過降低炎癥因子表達(dá)量,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外,VEGF作為一種多效性血管生長(zhǎng)因子,可誘導(dǎo)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化。并有研究表明VEGF可作為miR-377的直接靶點(diǎn)誘導(dǎo)血管生成相關(guān)細(xì)胞的增殖[18]。因而,抑制miR-377可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活、促進(jìn)血管再生。

2.1.4 miR-3473b Wang X等人[19]發(fā)現(xiàn)MCAO小鼠同側(cè)皮質(zhì)、紋狀體中miR-3473b水平顯著增加。這與體外被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)或OGD激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-3437b的水平變化一致。經(jīng)注射miRNA-3437b抑制劑的小鼠相比對(duì)照組而言,大腦同側(cè)皮質(zhì)及紋狀體中的梗死體積顯著減少且神經(jīng)功能評(píng)分得以改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SOCS3(細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3)上存在miR-3437b的結(jié)合位點(diǎn)。SOCS3作為細(xì)胞因子誘導(dǎo)蛋白,能夠?qū)γ庖呒?xì)胞中細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抑制作用[20],尤其針對(duì)IL-6炎性家族。因此,miR-3437b可通過靶向抑制SOCS3的表達(dá)介導(dǎo)腦缺血損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞中的神經(jīng)炎癥。

2.1.5 miR-155 miR-155與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。最新研究表明[21]miR-155介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血損傷中的炎癥反應(yīng),可歸納為以下幾個(gè)方面：(1)miR- 155直接作用于SOCS-1(細(xì)胞信號(hào)抑制因子-1)、SOCS-6和SHIP-1,抑制細(xì)胞因子信號(hào)的傳導(dǎo),抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化。其機(jī)制為miR-155直接結(jié)合到SOCS-1與SHIP中,減弱STAT-3的活性,其中STAT-3是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的指標(biāo);(2)顯微鏡下觀察在注射miR-155后,血管周圍聚集的小膠質(zhì)細(xì)胞/吞噬細(xì)胞減少,提示miR-155抑制活化后小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)血管的吞噬作用;(3)調(diào)控免疫細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)表型轉(zhuǎn)化：在miR-155抑制劑注射7 d后,M1表型標(biāo)志物CD45與CD86的表達(dá)下降。而M2型激活因子：IL-10與CD-45的表達(dá)上調(diào),IL-10可通過激活CD-45磷酸化,從而負(fù)向調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。因而miRNA-155能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的分化及抗炎表型的極化。在此基礎(chǔ)上,Wen Y等人[22]用100 mol/L的旋覆花內(nèi)酯(acetylbritannilactone,ABL)處理BV2細(xì)胞后,可消除mi-155的增長(zhǎng)。其機(jī)制為ABL通過抑制NF-κB、TLR4表達(dá)和促進(jìn)MyD88、SOCS1及I-κB的表達(dá),進(jìn)而抑制CGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)。因而,靶向應(yīng)用MiR-155可為抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活提供新策略。

2.2 負(fù)向調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活及促使M2型轉(zhuǎn)化

2.2.1 miRNA203 髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)通過誘發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1核轉(zhuǎn)位,增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)病原體的免疫應(yīng)答。已研究證明[23]MyD88介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥。此外,miR-203在病理及生理免疫反應(yīng)中也起到重要作用。Yanga等人[24]發(fā)現(xiàn)在OGD誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中,MyD88可作為miR-23調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子的重要靶點(diǎn),直接調(diào)控MyD88轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),減弱NF-κB、IL-1β等炎性因子的表達(dá)活性。過表達(dá)miR-203可減少神經(jīng)炎癥,改善神經(jīng)元功能。這一發(fā)現(xiàn)為腦缺血損傷的治療提供新靶點(diǎn)。

2.2.2 miR-93與miR-27a 白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK4)可增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞中NO和TNF-α的釋放,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中[25],小膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-93水平與IRAK4的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。ELISA結(jié)果顯示,在腦缺血再灌注小鼠體內(nèi)注射miR-93模擬物容易導(dǎo)致RAK4的蛋白表達(dá)量減少,IL-1、TNF-α的釋放減少,抑制神經(jīng)元凋亡。因此,miR-93可抑制腦缺血再灌注中炎癥因子釋放,抑制缺氧后小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。然而,關(guān)于IRAK4能否成為miR-93的直接靶點(diǎn)尚不確定。

隨后Lv等[26]對(duì)miR-27a是否能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-27a可顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性因子白介素-6 (IL-6)、白介素-1β (IL-1b)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和一氧化氮(NO)的表達(dá),其機(jī)制為miR-27a可直接靶向結(jié)合到IRAK4、TLR4的3’非翻譯區(qū),抑制其表達(dá)。進(jìn)一步佐證了IRAK4可作為miRNA對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活影響的重要靶點(diǎn)的可能性。

2.2.3 miRNA-124 miRNA-124在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá),對(duì)維持大腦小膠質(zhì)細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)具有重要作用。在缺血缺氧環(huán)境下,miR-124通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白-a(C/EBP-a)及其下游靶蛋白pu1,可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞從激活狀態(tài)變?yōu)殪o止?fàn)顟B(tài),減少神經(jīng)炎性因子的釋放。有研究顯示[27]miRNA-124水平與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥呈負(fù)相關(guān),在腦缺血損傷大腦內(nèi)早期注射miRNA-124可增加Arg-1表達(dá),促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型的轉(zhuǎn)化、提高神經(jīng)元存活率。且miRNA-124在腦缺血損傷中的表達(dá)作用具有區(qū)域和時(shí)間依賴性,早期注射及持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間注射能夠?qū)⑵渖窠?jīng)保護(hù)作用發(fā)揮到最大。Hamzei等人[28]分別在促炎高峰期之前、之后給予miR-124注射,以此觀察miRNA最佳治療時(shí)間窗,其中miR-124在促炎高峰前注射能顯著使激活的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化,與之前研究結(jié)果一致。此外,有研究發(fā)現(xiàn)D-4F[29]作為一種具有抗炎作用的載脂蛋白可通過增加體內(nèi)、體外microRNA-124水平,促進(jìn)1型糖尿病型腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),其機(jī)制為miRNA-124可通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化、降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9、腫瘤壞死因子-1和toll樣受體-4基因表達(dá),改善神經(jīng)功能與維持血腦屏障的完整性。因此,在缺血缺氧環(huán)境下,miRNA-124可通過結(jié)合多個(gè)靶點(diǎn)抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生、減少神經(jīng)元凋亡及降低血腦屏障的破壞。

2.2.4 miRNA-1906 在腦缺血損傷中TLR4的表達(dá)增多介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥介質(zhì)的釋放(miRNA調(diào)控Toll 樣受體4參與神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性損傷的研究進(jìn)展)。Xu XM等人[30]在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的表達(dá)多伴隨著神經(jīng)細(xì)胞毒性的發(fā)生,不利于神經(jīng)功能的恢復(fù),當(dāng)體內(nèi)注射miR-1906激動(dòng)劑后,TLR4的表達(dá)量受到抑制。應(yīng)用microRNA圖譜確定TLR4為miR-1906的靶向結(jié)合位點(diǎn)。此外,在TLR4基因敲除的小鼠中miR-1906的神經(jīng)保護(hù)作用消失。提示miR-1906在腦缺血損傷中的保護(hù)作用依賴TLR4的表達(dá)。

2.2.5 miR-26b 先前已有研究表明OGD誘導(dǎo)下的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6表達(dá)增多,miR-26b的表達(dá)下降,為進(jìn)一步確定IL-6與miR-26b在腦缺血中的關(guān)系,Kang YC等人[31]運(yùn)用熒光素酶實(shí)驗(yàn)以確定OGD-小膠質(zhì)細(xì)胞與MCAO小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-26b的靶基因,結(jié)果表明miR-26b能夠直接結(jié)合到IL-6的3’端的非翻譯區(qū),抑制其轉(zhuǎn)錄,減少大腦神經(jīng)炎癥與損傷。此外,miR-26b在介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活過程中,仍存在許多下游靶基因。進(jìn)一步研究可為腦缺血治療提供新靶點(diǎn)。

3 小結(jié)與展望

綜上所述,miRNA作為一種可同時(shí)調(diào)控多種通路及蛋白的非編碼RNA,可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及M1表型極化,從而減少腦缺損傷中神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但目前為止,miRNA相關(guān)抑制劑及模擬物還未在臨床實(shí)踐中開展,主要在于miRNA的給藥途徑多為側(cè)腦室注射,不易被患者接受。我們應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究,以確保日后臨床上安全及有效實(shí)施。由于小膠質(zhì)細(xì)胞表型空間分布特征不夠明確,miRNA的注射時(shí)間也有待進(jìn)一步研究。此外,小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎與抗炎表型并非相互對(duì)立,探究miRNA維持小膠質(zhì)細(xì)胞表型的穩(wěn)定狀態(tài)可能是未來(lái)研究方向。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與周圍環(huán)境關(guān)系密切,因此探究miRNA在多種小膠質(zhì)細(xì)胞中相互作用機(jī)制,可為腦缺血損傷治療提供新靶點(diǎn)。