李煜超， 王 燕綜述， 鄒 偉審校

腦卒中又稱中風(fēng),是一種急性腦血管疾病,其主要特征為腦部血管突然破裂或大腦供血中斷引起腦組織損傷進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙,包括缺血性和出血性卒中。在全球范圍內(nèi),卒中已成為僅次于缺血性心臟病的第二大死因。目前,研究發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與了卒中發(fā)生和發(fā)展相關(guān)生物進(jìn)程。此外,泛素蛋白酶體系統(tǒng)與造成卒中后神經(jīng)損傷的許多信號(hào)通路存在聯(lián)系。但是具體機(jī)制尚不明晰。本文探討了泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與腦卒中后相關(guān)病理過(guò)程的機(jī)制,為進(jìn)一步研究泛素蛋白酶體系統(tǒng)和腦卒中的治療提供理論依據(jù)。

1 泛素蛋白酶體系統(tǒng)

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要非溶酶體途徑,該系統(tǒng)不僅降解錯(cuò)誤折疊或氧化的蛋白質(zhì),還降解具有基本功能的蛋白質(zhì),是生理和病理?xiàng)l件下維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要系統(tǒng)。UPS參與許多細(xì)胞過(guò)程,包括DNA修復(fù),內(nèi)吞運(yùn)輸和免疫反應(yīng)。UPS對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病也非常重要。在阿爾茲海默癥和帕金森病這類因異常蛋白積累而形成的神經(jīng)退行性病變中,UPS參與了異常蛋白的清理[1]。另外,UPS還參與調(diào)控腦血管病的主要危險(xiǎn)因素如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高脂血癥等。

2 UPS與腦卒中

UPS與腦卒中后相關(guān)的病理變化密切相關(guān),包括線粒體損傷、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等。在缺血性卒中后,由于Ca2+超載或線粒體轉(zhuǎn)換孔的打開(kāi)等因素,最終導(dǎo)致線粒體功能障礙。而在腦出血中,線粒體呼吸功能障礙是導(dǎo)致腦出血后血腫中氧代謝減少的原因。對(duì)功能障礙線粒體的清除有助于神經(jīng)細(xì)胞的生存。線粒體自噬是線粒體質(zhì)量和數(shù)量的重要調(diào)控途徑,而UPS在線粒體自噬的調(diào)控中起著重要作用[2]。線粒體是氧化能量中心,是細(xì)胞生存所必需的細(xì)胞器,而老化或受損的線粒體是有毒活性氧的來(lái)源。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是氧化應(yīng)激中重要的信號(hào)分子,在腦卒中病理表現(xiàn)中,相對(duì)過(guò)量的ROS將破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體損害。Keap1-Nrf2途徑是對(duì)氧化應(yīng)激的主要保護(hù)反應(yīng),UPS可以通過(guò)該通路來(lái)嚴(yán)格調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的轉(zhuǎn)錄,從而影響抗氧化過(guò)程。炎癥是腦卒中后最常見(jiàn)的病理表現(xiàn)之一,可由多種原因引起。炎癥的發(fā)生會(huì)引起神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。有研究顯示,UPS參與炎癥的調(diào)控。調(diào)節(jié)UPS可能是控制炎癥的有效途徑。因此,在卒中過(guò)程中,通過(guò)UPS調(diào)控相關(guān)通路及其關(guān)鍵蛋白可能是保護(hù)神經(jīng)元和防止細(xì)胞死亡的有效解決方案。

3 泛素蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制

3.1 NF-κB通路與泛素蛋白酶體系統(tǒng) 在靜息狀態(tài)下,NF-кB與抑制因子IкB相結(jié)合以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中。NF-кB信號(hào)通路主要包括經(jīng)典和非經(jīng)典激活途徑。在經(jīng)典的NF-кB信號(hào)通路中,當(dāng)細(xì)胞受到促炎因子、生長(zhǎng)因子、免疫受體配體及應(yīng)激反應(yīng)等刺激時(shí),IKK復(fù)合體被激活?；罨腎KK能特異地催化IκB特定部位絲氨酸(serine,ser)殘基的磷酸化。IκB的磷酸化導(dǎo)致其氨基端第21和22位賴氨酸殘基通過(guò)SCF型E3泛素連接酶復(fù)合物與多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合,這種結(jié)合使IκB的空間構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致其被ATP依賴性26S的蛋白酶體所識(shí)別并降解[3]。當(dāng)抑制因子IκB與NF-κB解聚后,釋放的NF-κB二聚體通過(guò)各種翻譯后修飾被進(jìn)一步激活,導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-2、IL-6和INF-γ的產(chǎn)生和釋放。非經(jīng)典的NF-кB途徑激活依賴于受體激活激酶NIK,NIK可激活I(lǐng)KK復(fù)合體中的IKKα亞基。應(yīng)激條件下,活化后的IKKα可將NF-κB2 p100的C端殘基磷酸化,隨后導(dǎo)致其自身的泛素化,經(jīng)蛋白酶體識(shí)別并部分降解為p52,最終p52-RelB異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[4]。促炎細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)促使組織損傷,NF-κB作為調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中促炎基因表達(dá)的中樞轉(zhuǎn)錄因子,在急、慢性炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。

3.2 PINK1/Parkin通路與泛素蛋白酶體系統(tǒng) Parkin是一種E3泛素連接酶,而PINK1作為Parkin的上游因子,對(duì)激活Parkin和將Parkin招募到去極化線粒體上都至關(guān)重要。在生理情況下,PINK1的跨膜段部分被位于內(nèi)膜的早老素相關(guān)菱形蛋白(presenilins-associated rhomboid-like protein,PARL)以蛋白質(zhì)水解方式切割,被切割的PINK1在其N端暴露不穩(wěn)定的氨基酸殘基,并釋放到細(xì)胞質(zhì),E3泛素連接酶(UBR1、UBR2和UBR4)以N端規(guī)則將其泛素化后通過(guò)蛋白酶體迅速降解[5]。當(dāng)線粒體膜電位出現(xiàn)異常時(shí),PINK1逃避了PARL介導(dǎo)的切割和N端規(guī)則依賴性降解,穩(wěn)定地與外膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of the outer membrane,TOM)結(jié)合,并積聚在線粒體外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)上。在MOM上積累的PINK1可以通過(guò)兩種方式激活Parkin。一方面,PINK1通過(guò)直接磷酸化Parkin的UBL結(jié)構(gòu)域中的Ser65激活Parkin[6]；另一方面,PINK1磷酸化在基礎(chǔ)水平時(shí)與MOM結(jié)合的泛素的Ser65。Parkin對(duì)磷酸化泛素的高度親和力促使其定位于線粒體。被激活的Parkin進(jìn)一步將泛素結(jié)合到MOM蛋白上,隨后泛素又會(huì)被PINK1磷酸化[7]。PINK1生成的磷酸化泛素作為線粒體上的自噬信號(hào),而Parkin將其放大。隨后,被泛素化的MOM蛋白招募自噬銜接蛋白SQSTM1/P62到受損線粒體,通過(guò)自噬促進(jìn)其降解。在PINK1/Parkin途徑中存在著一些與UPS相關(guān)的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制,這對(duì)線粒體自噬的穩(wěn)定非常重要。泛素特異性蛋白酶30(Ubquitin-specific protease 30,USP30)是一種定位于MOM的去泛素化酶,USP30的存在可以維持MOM蛋白泛素化的穩(wěn)態(tài),防止過(guò)度的線粒體自噬[8]。

3.3 Keap1-Nrf2通路與泛素蛋白酶體系統(tǒng) 核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-related factor,Nrf2)是氧化還原和代謝穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,具有7個(gè)Nrf2-ECH同源結(jié)構(gòu)域(Neh1-Neh7),每個(gè)結(jié)構(gòu)域都具有不同的功能。其中Neh2作為Nrf2最重要的調(diào)控結(jié)構(gòu)域,包括兩個(gè)基序DLG和ETGE,它們可通過(guò)與其他蛋白質(zhì)(如Keap1)的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性和泛素化[9]。在正常條件下,Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域通過(guò)DLG和ETGE基序的介導(dǎo)在細(xì)胞漿中與Keap1中的Kelch/DGR域相互作用,Keap1-Cul3-E3泛素連接酶靶向定位于Nrf2 N端的Neh2結(jié)構(gòu)域的多個(gè)賴氨酸殘基,并促進(jìn)Nrf2的泛素化,泛素化后的Nrf2被遞送至26S蛋白酶體進(jìn)行降解[10]。氧化應(yīng)激條件下,Keap1中的關(guān)鍵半胱氨酸殘基(cysteine,Cys),尤其是Cys151,充當(dāng)損傷細(xì)胞的傳感器,并被親電物質(zhì)或ROS共價(jià)修飾[11]。這種修飾可能通過(guò)破壞Kelch結(jié)構(gòu)域和DLG基序之間的低親和力相互作用,從而誘導(dǎo)Keap1的構(gòu)象變化,導(dǎo)致Nrf2泛素化受損,阻斷UPS介導(dǎo)的降解,增加Nrf2蛋白水平[12]。

4 腦卒中后UPS在信號(hào)通路中的作用

4.1 泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控的PINK1/Parkin通路與腦卒中 在腦卒中引起的線粒體功能障礙時(shí),PINK1/Parkin通路介導(dǎo)功能障礙MOM蛋白的泛素化,隨后通過(guò)與自噬的串?dāng)_清除異常線粒體。事實(shí)上PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體泛素化是線粒體自噬的基礎(chǔ),非活性PINK1不能激活或招募Parkin到線粒體[13]。阻止Parkin的線粒體易位,減少Parkin磷酸化,降低磷酸化泛素水平,可以抑制各種線粒體損傷因子誘導(dǎo)的線粒體自噬[14]。Rakovic等研究發(fā)現(xiàn)[15],MOM蛋白可以通過(guò)不依賴自噬的UPS途徑降解。較大的MOM蛋白MFN2和TOM70僅通過(guò)UPS降解。同時(shí),較大MOM蛋白的降解影響了MOM的穩(wěn)定性導(dǎo)致其破裂,最終導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)蛋白的二次降解[16]。在氧葡萄糖剝奪(OGD)神經(jīng)模型中,與對(duì)照組相比,PINK1敲除組更容易受到缺血損傷[17]。另外,在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)中,Parkin的缺失會(huì)增加ROS的產(chǎn)生,促進(jìn)氧化應(yīng)激,進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[18]。缺血誘導(dǎo)的大鼠模型的海馬神經(jīng)元中,PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬起到神經(jīng)保護(hù)作用[19]。這說(shuō)明,PINK1或Parkin基因缺失都會(huì)加重神經(jīng)元損傷,而在腦卒中后,提高PINK1和Parkin的表達(dá)可以避免大量神經(jīng)細(xì)胞死亡。因此,在后續(xù)研究中有必要關(guān)注PINK1/Parkin/UPS機(jī)制在腦卒中后線粒體損傷中的作用。

4.2 泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與NF-κB通路與腦卒中 UPS可通過(guò)調(diào)控多種炎癥調(diào)節(jié)蛋白,在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]。腦缺血再灌注過(guò)程中,細(xì)胞受到氧自由基等因素的刺激,激活I(lǐng)KK,引起IкB磷酸化和泛素化,最終被蛋白酶體識(shí)別并降解,NF-κB入核引起炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。腦損傷時(shí)IKKα/β被激活,導(dǎo)致IκB的蛋白酶體降解,從而促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,引發(fā)炎癥[21]。在卒中急性期,迷走神經(jīng)刺激可以通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB通路促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞極化并抑制M1小膠質(zhì)細(xì)胞極化以減輕腦損傷[22]。由此可知,抑制NF-κB的活性,可以減輕腦出血或腦缺血后的神經(jīng)損傷[23]。UPS與NF-κB的激活有關(guān),通過(guò)干預(yù)UPS可以阻止IκB降解,抑制NF-κB的活性,使NF-κB與IκB結(jié)合在細(xì)胞溶質(zhì)中,并且能夠有效減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)和再灌注損傷[24]。Phillips等對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠應(yīng)用蛋白酶體抑制劑PS519,發(fā)現(xiàn)PS519可減輕腦損傷大鼠的炎癥并改善神經(jīng)功能恢復(fù)[25]。研究發(fā)現(xiàn),雖然早期干預(yù)UPS在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB過(guò)度表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)作用,但長(zhǎng)期蛋白酶體活性降低與細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集和遲發(fā)性神經(jīng)元變性以及死亡有關(guān)[26]。說(shuō)明UPS可能對(duì)缺血后的神經(jīng)元發(fā)揮雙重作用。提示我們盡管蛋白酶體抑制劑已被證明可在腦缺血中提供保護(hù),但因蛋白酶體活性下降導(dǎo)致的其他神經(jīng)損傷問(wèn)題不能被忽略。

4.3 泛素蛋白酶體系統(tǒng)通過(guò)Keap1-Nrf2參與腦卒中 Nrf2從Keap1抑制中逃逸是Nrf2介導(dǎo)激活的關(guān)鍵事件。腦缺血或腦出血期間,氧化應(yīng)激使Keap1構(gòu)象發(fā)生變化,Nrf2解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與ARE結(jié)合,激活下游抗氧化酶等細(xì)胞保護(hù)蛋白的因表達(dá)。研究表明,缺血腦組織中Nrf2表達(dá)顯著上調(diào),多種Nrf2誘導(dǎo)劑在腦缺血后均具有神經(jīng)保護(hù)作用[27]。富馬酸二甲酯(DMF)的直接代謝產(chǎn)物富馬酸一甲酯可直接修飾Keap1的Cys151,促進(jìn)Nrf2解離起到神經(jīng)保護(hù)作用[28]。此外,在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y中,miR-7可靶向抑制Keap1 mRNA的翻譯,從而阻止Nrf2蛋白的降解,增加Nrf2的表達(dá)量起到細(xì)胞保護(hù)作用[29]。雖然這些試劑還需在腦卒中模型中進(jìn)一步研究,但是不可否認(rèn)的是,在腦卒中后神經(jīng)元保護(hù)方面,通過(guò)對(duì)Keap1的修飾或抑制,阻止Nrf2被蛋白酶體降解是一個(gè)有前景的措施。

5 展 望

UPS是細(xì)胞溶質(zhì)、核蛋白和跨膜蛋白降解的主要途徑,也是維持神經(jīng)發(fā)育、大腦結(jié)構(gòu)和功能的主要調(diào)節(jié)器。腦卒中后,由于神經(jīng)元生存的內(nèi)環(huán)境被破壞,引起一系列神經(jīng)元損傷事件,最終引起神經(jīng)細(xì)胞死亡,導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失。近年來(lái),對(duì)UPS的相關(guān)研究越來(lái)越多。研究發(fā)現(xiàn)UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的重要機(jī)制,參與這一生物學(xué)過(guò)程的成分主要包括泛素及其相關(guān)啟動(dòng)酶,UPS對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有十分重要的作用。目前,腦卒中相關(guān)生理病理機(jī)制研究有較多研究成果,然而關(guān)于UPS與腦卒中的探討不足,缺乏可供參考的文獻(xiàn)。盡管如此,它仍然可能成為基礎(chǔ)研究和潛在臨床應(yīng)用的新熱點(diǎn)。需要注意的是,泛素化蛋白質(zhì)的聚集是腦卒中后的重要特征之一[30]。UPS與線粒體自噬、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等腦卒中后相關(guān)病理變化的通路的聯(lián)系非常密切。研究UPS在PINK1/Parkin、NF-κB、Keap1-Nrf2等通路的調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)于腦卒中患者的臨床治療及預(yù)后有重要意義。

目前,還有許多問(wèn)題需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,從維持穩(wěn)態(tài)角度看,需要明確如何適度的激活或抑制UPS來(lái)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。腦卒中病理過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,需要注意分期分階段觀察UPS的變化。由于缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物副作用的研究和臨床試驗(yàn)的結(jié)果,UPS調(diào)節(jié)藥物是否介導(dǎo)腦卒中后的細(xì)胞保護(hù)或細(xì)胞毒性的結(jié)論依然存在爭(zhēng)議。深入探討UPS與腦卒中之間的關(guān)系及其發(fā)生機(jī)制,對(duì)改善腦卒中患者的預(yù)后有巨大潛力。