高 群， 胡 深， 樊靜雯， 王大明

嚙齒類動物已發(fā)展成為準確描述疾病生物學(xué)基本過程不可或缺的工具[1]。隨著嚙齒類動物的大量應(yīng)用，改良的成像技術(shù)(如CT和MR)已被廣泛用于小動物模型[2]。作為侵入性成像的技術(shù)之一，選擇性動脈插管聯(lián)合數(shù)字剪影血管造影術(shù)(Digital silhouette angiography，DSA)是能夠呈現(xiàn)實時藥物、細胞或器械時間和空間分辨的成像技術(shù)[3,4]。經(jīng)頸動脈和股動脈選擇性插管是嚙齒類動物模型常用的血管途徑[5,6]。然而，經(jīng)股動脈或頸動脈途徑引起的一側(cè)肢體或頸部的并發(fā)癥包括術(shù)后缺血、神經(jīng)損傷、感染等也較為常見[7,8]。由此導(dǎo)致的動物行為學(xué)變化以及致死致殘率常常影響實驗效果的評估。因此，課題組探索成年大鼠尾動脈鞘管通路在介入動物模型制作中的優(yōu)勢，設(shè)計出了一種便捷、可重復(fù)的介入操作方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取清潔級雄性成年Sprague Dawley(SD)大鼠6只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006)，體重650 g～700 g。大鼠分籠飼養(yǎng)于安靜環(huán)境中，晝夜自然光照射，自由飲水，室溫控制在22 ℃～25 ℃，術(shù)前禁食12 h。所有操作均按照NIH指南進行，并經(jīng)北京大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(批準號：LA2021426)。

1.2 實驗設(shè)備及器械 數(shù)字減影血管造影機(Philips，荷蘭)，18G靜脈留置針外套管(BD，美國)，直徑0.035英寸(0.87 mm)的導(dǎo)絲(泰爾茂，9F股動脈穿刺包)，碘克沙醇(320 mgI/ml)，造影微導(dǎo)管(Marathon microcatheter 1.5F/2.7F)及微導(dǎo)絲(Mirage Hydropphilic Guidewire 0.010 inchs)，1.5 mm×15 mm tazuna球囊，4.0 mm×20 mm solitaire支架及配套導(dǎo)管Rebar 18；手術(shù)刀柄，眼科剪，眼科鑷，止血鉗，持針器，玻璃分針，4-0醫(yī)用尼龍縫線(上海醫(yī)用縫合針廠)，放大鏡，直尺，游標帶表卡尺(精度0.01 mm)，1 ml、5 ml注射器，小動物動脈夾，消毒液，生理鹽水，木質(zhì)動物手術(shù)臺，無菌布巾，無菌紗布，橡皮筋。

1.3 手術(shù)方法 術(shù)前12 h停止進食，自由飲水。用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)，待全身麻醉后，將大鼠仰臥，四肢及頭部固定于木質(zhì)解剖臺，用熱毛毯保持體溫在36.5 ℃，尾部正中備皮、消毒。取距尾根部3 cm處行尾腹側(cè)正中直行切口，切口長1 cm，顯微剪刀切開筋膜，分離皮下結(jié)締組織，尾動脈距真皮質(zhì)約1 mm，在放大鏡下，可清晰顯示大鼠尾動脈，用剝離子將尾動脈與周圍小靜脈鈍性分離，避免銳性解剖，分離時動作要輕柔，切忌粗暴。安全有效地分離尾動脈約0.5 cm。分離結(jié)束后，局部滴入少許2%利多卡因避免痙攣，帶入2根4-0縫線，一根結(jié)扎尾動脈遠心端，另一根留近心端備用。利用近心端絲線將尾動脈提起后用動脈夾夾閉近端尾動脈，使用顯微剪將血管做魚嘴形切口，切口約為血管直徑的1/3～1/2大小，超過此范圍在置鞘時切口處易斷裂，小于該范圍鞘管不易進入尾動脈。置鞘管前需仔細檢查鞘管尖端是否光滑，導(dǎo)絲在鞘內(nèi)進退是否順利。使用5 ml注射器的針頭輔助挑起尾動脈斷端，緩慢在切口處由遠心端向尾動脈近心端置入導(dǎo)絲，然后經(jīng)導(dǎo)絲指引置入鞘管通道(見圖1)(在此過程中需顯微鑷輔助，注意操作輕柔，切勿扯斷動脈)，當鞘管頭端進入動脈3～5 mm時，動脈近端絲線即可結(jié)扎固定鞘管，緩慢抽出鞘管內(nèi)的導(dǎo)絲，經(jīng)動脈鞘管注入肝素100 IU/kg，維持動脈血流通暢，防止操作過程中血栓形成。

1.4 經(jīng)尾動脈血管造影及介入操作 成功置入尾動脈鞘管通道后，將0.010英寸(0.025 cm)微導(dǎo)絲及Marathon微導(dǎo)管(1.5 Fr)沿尾動脈鞘管通道依次進入尾動脈、薦中動脈、腹主動脈，撤出微導(dǎo)絲，行血管造影檢查導(dǎo)管是否位于腹主動脈，直視下繼續(xù)沿胸主動脈上行至主動脈弓處，導(dǎo)管到位后退出導(dǎo)絲，將高壓注射器連接管與微導(dǎo)管部連接后經(jīng)尾動脈注入對比劑碘克沙醇(0.2 ml/s，壓力100 psi，總量1.0 ml)。觀察主動脈弓及分支血管情況。完成主動脈弓造影后，繼續(xù)沿血管上行，在導(dǎo)絲指引下行選擇性頸總動脈、頸內(nèi)動脈造影；造影結(jié)束后，引入直徑1.5 mm×15 mm球囊，球囊順利通過尾動脈鞘管，于胸主動脈處擴張球囊，球囊充盈完全，緩慢撤回球囊，模擬球囊損傷/擴張模型。沿尾動脈鞘管引入Solitaire支架導(dǎo)管，至胸主動脈處釋放支架，支架釋放完全。造影及介入操作結(jié)束后拔出導(dǎo)管及留置鞘管，結(jié)扎尾動脈近心端，逐層縫合尾部切口，并腹腔內(nèi)注射1.5 ml抗生素溶液(80萬U青霉素+100萬U鏈霉素溶于250 ml生理鹽水)。

2 結(jié) 果

2.1 總體情況 全部6只SD大鼠均置尾動脈鞘管成功，成功率為100%(6/6)，未出現(xiàn)尾動脈暴露不良、導(dǎo)引導(dǎo)絲或留置鞘管穿破尾動脈以及鞘管無法置入等情況；術(shù)后1 w大鼠存活率為83.33%(5/6)，死亡主要原因是術(shù)后1 d尾部傷口裂開，失血過多所致；余5只大鼠全部存活，未出現(xiàn)因麻醉、大量出血和(或)感染死亡的情況。

2.2 改良18G鞘管可順利植入大鼠尾動脈 選取距尾基部3 cm處作為切開位點(見圖1A)，可見尾動脈由肌腱之間的腹筋膜覆蓋，處于適宜插管的位置，鈍性分離尾動脈帶入縫線(見圖1B)，結(jié)扎尾動脈遠端后經(jīng)動脈切口植入導(dǎo)絲(見圖1C、D)，鞘管內(nèi)徑(1.27 mm)大于導(dǎo)絲直徑(0.87 mm)，鞘管可經(jīng)導(dǎo)絲順利導(dǎo)引進入尾動脈(見圖1E、F)。本實驗所選大鼠尾動脈經(jīng)測量直徑約(1.19±0.14)mm，通過局部利多卡因預(yù)防血管痙攣以及導(dǎo)絲導(dǎo)引，在血管容受范圍內(nèi)可順利植入18G鞘管(1.27 mm) (見圖1F)。

圖1 大鼠尾動脈分離及插管。(A)尾動脈體表定位;(B)尾動脈分離、帶線;(C、D)導(dǎo)絲經(jīng)動脈切口置入尾動脈;(E、F)鞘管可順利通過導(dǎo)絲并在導(dǎo)絲指引下進入尾動脈

2.3 盆腔部血管造影 經(jīng)鞘管置入微導(dǎo)絲后引導(dǎo)微導(dǎo)管進入尾動脈，透視顯影顯示微導(dǎo)絲及微導(dǎo)管沿尾動脈走行，未出現(xiàn)鞘管通道異常及導(dǎo)管阻塞等情況(見圖2A、B)；沿尾動脈-薦中動脈繼續(xù)上行，顯示導(dǎo)管順利進入腹主動脈內(nèi)，至腹主動脈-腸系膜上動脈開口處行選擇性腸系膜上動脈造影，結(jié)果顯示腹主動脈第一腰椎高度發(fā)出腸系膜上動脈，動脈主干呈向右側(cè)稍凸的弓狀，從弓的凸側(cè)發(fā)出分支動脈(胰十二指腸動脈和空、回腸動脈)，凹側(cè)分支動脈為結(jié)腸動脈，并且透視下可見膀胱內(nèi)充盈代謝的造影劑(見圖2C)。

圖2 經(jīng)微導(dǎo)管選擇性腸系膜上動脈造影。(A)尾動脈鞘管通道完成;(B)微導(dǎo)絲、微導(dǎo)管以及鞘管在尾動脈的透視顯影圖;(C)腸系膜上動脈選擇性造影及充滿代謝性造影劑的膀胱。白色細箭頭示：微導(dǎo)絲；紅色細箭頭：微導(dǎo)管；白色粗箭頭：尾動脈鞘管頭端；紅色粗箭頭：腸系膜前動脈。白色虛線圈：膀胱

2.4 主動脈弓及分支血管造影 微導(dǎo)管在0.010英寸導(dǎo)絲引導(dǎo)下插至主動脈弓，行主動脈弓造影顯示雙側(cè)鎖骨下動脈及頸總動脈全程顯影，血管光滑規(guī)整(見圖3A～C)，在0.010英寸導(dǎo)絲引導(dǎo)下將微導(dǎo)管插至右側(cè)頸總動脈造影，頸總動脈分支頸外動脈及頸內(nèi)動脈清晰可見(見圖3D～G)，行大鼠造影時微導(dǎo)管未彈出，順利完成目標血管造影并獲得滿意的造影圖像。

圖3 主動脈弓及分支血管造影。(A)主動脈弓微導(dǎo)管到位;(B、C)主動脈弓及分支動脈造影正側(cè)位;(D～G)選擇性右側(cè)頸總動脈造影正側(cè)位

2.5 選擇性頸內(nèi)動脈造影 取左側(cè)頸總動脈路圖影，可見頸總動脈分為頸內(nèi)動脈及頸外動脈，頸內(nèi)動脈由下至上依次分為顱外翼顎動脈、顱內(nèi)大腦后動脈、大腦中動脈及大腦前動脈(見圖4A)，沿頸總動脈上行至頸動脈分叉部，頸內(nèi)動脈朝向后、外側(cè)走行，微導(dǎo)管在微導(dǎo)絲引導(dǎo)下進入頸內(nèi)動脈前段，造影顯示頸內(nèi)動脈首先分出翼顎動脈，進入顱內(nèi)后分為大腦后動脈、大腦中動脈以及大腦前動脈(見圖4B)。

圖4 選擇性左側(cè)頸外動脈造影。(A)正側(cè)位路圖下微導(dǎo)絲指引微導(dǎo)管到位;(B)微導(dǎo)管到位后造影顯示左側(cè)頸內(nèi)動脈顱外分支(翼顎動脈)及顱內(nèi)分支(大腦前、大腦后、大腦中動脈)

2.6 球囊及支架血管腔內(nèi)釋放 為了驗證球囊導(dǎo)管以及Solitaire FR支架導(dǎo)管直徑0.021英寸(0.533 mm)是否可以經(jīng)尾動脈鞘管進入主動脈，我們首先在體外測試球囊導(dǎo)管及支架導(dǎo)管是否可以通過鞘管，球囊導(dǎo)管及支架導(dǎo)管可以順利通過鞘管(見圖5A)；尾動脈置鞘完成后，體內(nèi)測試球囊導(dǎo)管及支架導(dǎo)管的通過程度，結(jié)果顯示，球囊導(dǎo)管以及支架導(dǎo)管不僅可以通過動脈鞘管，而且能夠在體內(nèi)完成充盈及釋放(見圖5B、C)。

圖5 球囊及支架導(dǎo)管可順利經(jīng)尾動脈鞘管進入主動脈。(A)體外檢測1.5 mm×15 mm球囊導(dǎo)管可順利通過18G鞘管;(B)球囊導(dǎo)管順利到達胸主動脈并且能夠完全充盈;(C)Solitaire FR支架導(dǎo)管到達胸主動脈并釋放

3 討 論

本文報道了利用大鼠尾動脈進行動脈鞘管置入的新方法，該方法可經(jīng)單一鞘管通道對大鼠進行連續(xù)的DSA造影和/或重復(fù)的介入操作。該方法將進一步提高大鼠作為人類疾病模型的應(yīng)用范圍。

介入血管術(shù)在神經(jīng)科、介入血管科、腫瘤科應(yīng)用廣泛；雖然對大型動物(如靈長類動物、豬或狗)的研究可用于獲得可靠的血管評估[9]，但研究費用昂貴、相關(guān)分子生物學(xué)試劑定制困難等情況，常常不利于精確描述疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基本過程；對于嚙齒類動物，由于體型較小血管較細，施行介入操作較為困難[10,11]。既往研究常采用經(jīng)股動脈或頸動脈直接置入導(dǎo)管法進行介入操作[12,13]，然而，股動脈或頸動脈不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜、解剖創(chuàng)面大，并且供血范圍廣泛，介入操作完成后結(jié)扎動脈殘端，極易發(fā)生一系列并發(fā)癥(術(shù)后缺血、神經(jīng)損傷、感染等)，影響動物神經(jīng)行為學(xué)評估以及造模后恢復(fù)[7,8]。近期國外研究者Kumagai等人報道利用大鼠尾動脈直接插管法進行動物介入研究[14]，該方法雖然簡易、迅速，有效避免了經(jīng)股、頸動脈通路帶來的并發(fā)癥，但是未能做到單一置管位點重復(fù)使用，導(dǎo)管退出之后需重新插管，存在術(shù)中退管動脈大出血等潛在問題。我們改良的尾動脈鞘管置入法通過可單一鞘管通路重復(fù)插入造影導(dǎo)管、球囊導(dǎo)管或支架導(dǎo)管，并且可在操作過程中滴注潤滑防止術(shù)中導(dǎo)管干澀、血栓形成。

研究中選用SD大鼠(650 g～700 g)，溫度保持36.5 ℃。尾近端3 cm內(nèi)，皆可作為置管位點，在此范圍血管直徑變化不大，可提高置管成功率。大鼠尾部主要的血供為“一動三靜”以及動靜脈側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，尾動脈位于大鼠腹側(cè)，為薦中動脈的延續(xù)，尾部腹側(cè)及兩側(cè)為靜脈。尾動脈在解剖學(xué)上位置淺表，容易暴露[8]。經(jīng)我們的實驗檢測尾動脈置入鞘管平均時間(11.00±1.90) min比既往研究(9.5±2.0) min[14]稍長，這可能與我們需要固定鞘管有關(guān)。既往研究股動脈插管所需的時間約為尾動脈的3倍[15]，這與解剖的復(fù)雜性有極大的相關(guān)性。在我們的研究中，股動脈插管時間(18.17±3.43) min大約是尾動脈的1.65倍，頸動脈插管時間(24.5±4.51) min 大約是尾動脈的2.23倍，這可能與操作者之前對頸動脈、股動脈位置以及解剖結(jié)構(gòu)較為熟悉有關(guān)。尾部血供豐富，尾側(cè)動脈的存在可以有效避免尾動脈結(jié)扎尾部缺血的發(fā)生[14]。尾動脈通路是高效、可重復(fù)、并發(fā)癥較低的介入通路，因此可以作為替代股動脈或頸動脈通路的一種選擇。

尾動脈“直線形”的解剖結(jié)構(gòu)使得介入操作在透射臺上可以很好的執(zhí)行。經(jīng)尾動脈入路對大鼠腦、內(nèi)臟、大血管和周圍血管造影獲得完整、可靠的造影結(jié)果。并且能夠經(jīng)尾動脈鞘管順利置入球囊導(dǎo)管以及支架導(dǎo)管，該技術(shù)的實現(xiàn)為大鼠內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化、腦梗死以及血管狹窄等疾病模型提供了技術(shù)支撐。該技術(shù)主要受限于靶血管及介入導(dǎo)管的直徑，在規(guī)格合適的范圍內(nèi)完全可以推廣到體重更輕、血管更細的嚙齒類動物。

綜上所述，我們利用大鼠尾動脈鞘管置入建立介入通路的方法，建立了單通道、可重復(fù)操作的大鼠介入動物模型，能夠很好探究介入大鼠模型的臨床表現(xiàn)、血管病變特征以及病理生理改變；而且可順利完成球囊及支架介入治療，這將為血管狹窄、動脈粥樣硬化、腦梗死、內(nèi)皮損傷、腫瘤等大鼠模型的研究提供一個嶄新的平臺。