余金慧，馬文文，陳 欣，湯永濤，周傳江＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

目前，由于十年禁漁，魚類資源在部分水域銳減，對于瀕危且資源量稀少的魚類進(jìn)行資源調(diào)查存在諸多困難，同時基于DNA和eDNA在魚類分類鑒定方面的迅猛發(fā)展[1]，對瀕危物種的資源檢測日益重要，從館藏標(biāo)本中獲取基因信息成為有效補充途徑，但對于福爾馬林標(biāo)本中提取目的基因片段的相關(guān)報道較少[2-6]，因此提取館藏福爾馬林保存瀕危魚類的DNA，并獲得保護(hù)魚類有效的eDNA引物，對于有效獲取水體中魚類時空分布和資源量信息具有積極推動作用。福爾馬林保存樣品中獲得的DNA在生物進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育、保護(hù)瀕危物種以及研究種群遺傳學(xué)中也具有重要意義[7-8]。

福爾馬林是一種保存標(biāo)本常用防腐劑，但在長期保存條件下，隨著保存時間的延長，提取的DNA質(zhì)量會逐漸下降。近期研究表明，福爾馬林并未破環(huán)DNA的分子結(jié)構(gòu)，DNA仍完整地存在于組織中，僅僅造成基因與基因、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、基因與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)作用[5]，需要用緩沖液長時間的進(jìn)行浸泡和置換[9]。提取DNA的結(jié)果也受到多方面因素的影響，實驗過程中樣本的大小和采樣部位都會影響提取DNA的質(zhì)量[8]和獲得量，保存標(biāo)本過程中的溫度也會影響DNA保存的效果。原位雜交實驗也顯示DNA并沒有由于福爾馬林的長期浸泡而被消解，只是造成DNA發(fā)生交聯(lián)作用難以獲得[9]。由于實驗方法、標(biāo)本保存環(huán)境和條件的不同，解交聯(lián)的效果不同，難以保證基因與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)被完全解開，所獲得的基因會發(fā)生片段化，因此本研究先從短片段提取和擴(kuò)增開始進(jìn)行實驗探索。

現(xiàn)有福爾馬林保存標(biāo)本提取及富集DNA的實驗中，實驗材料保存時間多在1年以下，因此根據(jù)之前的實驗方法對提取及富集DNA的步驟做了以下幾方面的優(yōu)化[10-14]：通過增加緩沖液置換的時間，并在此期間進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訜?；增加蛋白酶K、DTT、SDS等的用量；減少DNA的凍融次數(shù)和時間；擴(kuò)增過程中適當(dāng)提高退火溫度等方法，經(jīng)過多方組合優(yōu)化后均可顯著提高實驗的成功率（DNA含量和擴(kuò)增片段的長度）。具體優(yōu)化后實驗方法報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

實驗材料：兩尾九十年代福爾馬林保存的北方銅魚標(biāo)本（分別用1、2表示）；采用長江流域酒精保存的銅魚；一對基于銅魚（Coreius heterodon，登錄號：NC020042、JF906110）、圓口銅魚（Coreius guichenoti，登錄號：NC020041、JF906108）利用BioEdit軟件自行設(shè)計的線粒體DNA細(xì)胞色素b引物Cytb-1。

表1 銅魚屬DNA Cytb-1擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件

實驗試劑：1×GTE溶液（100mmoL/L氨基乙酸、10mmoL/L Tris-HCL、1mmoL/L EDTA）；DTT（二硫蘇糖醇）；SDS（十二烷基磺酸鈉）；蛋白酶K；NH4Ac（醋酸銨）；ddH2O。

1.2 實驗方法

經(jīng)過對比現(xiàn)有已報道方法并結(jié)合提取效果，總結(jié)為以下優(yōu)化后的實驗方法。以越南鱊、興凱鱊作為外類群，使用Phylosuite軟件[15]基于貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)（BIC），每1000代取樣一次，運行結(jié)束后，丟棄25%的樣本，對剩余的抽樣樹進(jìn)行整合，構(gòu)建50%的一致樹，使用后驗概率值（PP）作為節(jié)點支持率，構(gòu)建北方銅魚的系統(tǒng)發(fā)育樹，以證實本實驗方法的可行性、準(zhǔn)確性。

1.2.1 DNA的提取

用剪刀、鑷子選取固定形態(tài)、保存狀況良好的福爾馬林標(biāo)本，取2g的肌肉組織、背鰭鰭條、鰓蓋邊緣；將組織放入1.5mL的離心管中，加入1mL1×GTE緩沖液，水浴鍋60℃孵育7d，每12h換一次緩沖溶液，消化過程中進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼鹗?；吸取GTE溶液，室溫干燥；加入500μLGTE溶液95℃，水浴加熱15min，室溫冷卻5min，吸去GTE溶液；加入100μL蛋白酶K、50μL SDS、50μL DTT，60℃水浴加熱24h；若溶液仍為渾濁狀態(tài)，應(yīng)再添加蛋白酶K、DTT，在此過程中可添加較多的DTT，以提高提取效率；冷卻至室溫；加入500μL苯酚，均勻混合，離心機10000r/min，離心10min，保留上清液。重復(fù)3次；加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，0.5倍體積的NH4Ac，放入-20℃保存24h；離心機6000r/min，離心10min，保留沉淀；室溫干燥5h；加入40μL ddH2O溶解即得到DNA提取液。

1.2.2 DNA的擴(kuò)增

10μl體系擴(kuò)增，選擇北方銅魚的目的基因（PCR擴(kuò)增的模板）、引物Cytb-1、引物Cytb-2、Mix酶、ddH2O，PCR擴(kuò)增如下：預(yù)變性選擇94℃，5min；變性94℃，40s；復(fù)性選擇53℃，40s；延伸選擇72℃，80s；共35個循環(huán)；72℃，10min；最后12℃停止。

第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量不足，不能達(dá)到測序要求，為此，本文使用二次PCR進(jìn)一步富集。二次PCR的方法為第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為二次PCR擴(kuò)增的模板，其他步驟與第一次PCR相同。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行凝膠電泳制備1%瓊脂糖凝膠，點樣、電泳。凝膠成像如圖1所示：

圖1 Cytb-1引物二次PCR產(chǎn)物電泳圖

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究選擇北方銅魚（Coreius septentrionalis）、銅魚（Coreius heterodon）棒花魚（Abbottina rivularis）各1條Cytb基因序列，圓口銅魚（Coreius guichenoti）和麥穗魚（Pseudorasbora parva）各2條Cytb基因序列，根據(jù)最佳分區(qū)模型和最適核苷酸替代模型，構(gòu)建貝葉斯樹（MrBayes）。結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于Cytb基因的貝葉斯法（MrBayes）系統(tǒng)發(fā)育樹。節(jié)點上的數(shù)字是MrBayes的支持率，物種名稱后面的數(shù)字是GenBank登錄號。圖中顯示了外類群，北方銅魚（Coreius septentrionalis）加粗放大。

2 結(jié)果及分析

結(jié)果顯示提取銅魚（酒精保存）的DNA濃度平均值為245.7ng/μL，提取北方銅魚（福爾馬林保存）的DNA濃度平均值為485.5ng/μL，A260/280=1.57～1.80?？梢钥闯龃藢嶒灧椒梢蕴崛NA片段，其中可能存在蛋白質(zhì)、碳水化合物等因素的影響。

圖1是Cytb-1引物二次PCR的電泳圖，設(shè)計的目的條帶為204bp，電泳條帶與目的條帶長度在同一范圍內(nèi)，且通過測序成功得到目的條帶的基因序列。但由于在擴(kuò)增過程中為了避免模板濃度低、電泳過程中目的條帶不明顯，實驗中引物量略多，在電泳圖中可以看到引物二聚體。可根據(jù)實驗適當(dāng)減少引物用量，以進(jìn)行二次PCR。圖2表示依據(jù)Cytb基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示北方銅魚與銅魚、圓口銅魚親緣關(guān)系最近，且銅魚屬成為單系群，越南鱊和興凱鱊位于系統(tǒng)發(fā)育樹基部位置?？梢宰C實實驗方法的可行性和準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與展望

使用此方法已成功提取出北方銅魚的Cytb基因片段，所獲得的基因最大片段在400bp左右，但實驗周期較長。根據(jù)實驗研究發(fā)現(xiàn)，提取的質(zhì)量和測序的成功率隨保存時間增加而降低[16-17]。根據(jù)夏穎哲等實驗方法，可以得到長片段的DNA，但是實驗過程中并未獲得長片段的基因，因此推測可能是以下原因：

（1）基因與基因、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、基因與蛋白質(zhì)之間確實存在交聯(lián)作用[5]，導(dǎo)致DNA難以提取。我們在實驗中未能成功獲得大片段基因，可能是由于不同標(biāo)本保存時間、狀態(tài)以及保存過程中環(huán)境條件的不同[8]，實驗試劑、設(shè)備的不同等原因?qū)е绿崛NA的效果不盡相同?？筛鶕?jù)自身實驗條件、實驗對象保存情況對實驗方法進(jìn)行優(yōu)化，提取甲醛標(biāo)本基因片段的實驗仍需要進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以進(jìn)一步提高解交聯(lián)的效果。

（2）也可能基因與基因、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、基因與蛋白質(zhì)之間并不存在解交聯(lián)的過程，館藏樣品組織中的基因組確實受到福爾馬林長期作用的影響發(fā)生片段化，而提取過程的處理使其基因發(fā)生片段化加劇。

導(dǎo)致福爾馬林保藏標(biāo)本提取基因片段困難的原因未能獲得一致認(rèn)可，基因與基因、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、基因與蛋白質(zhì)之間存在的交聯(lián)作用使提取基因片段效果不佳的結(jié)論，還需要進(jìn)一步進(jìn)行科學(xué)研究和探索。