李玉明 廖程娟 朱沅如 劉 悅 潘育方 楊慧文

廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的一種以高血糖為特征的代謝性疾病，主要由胰島素抵抗引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1]，是一種最常見的糖尿病類型，在糖尿病人群中占90%以上[2]。最新調(diào)查顯示，2型糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，表明我國糖尿病防治工作仍面臨巨大挑戰(zhàn)。2型糖尿病患者往往存在脂代謝紊亂，如高甘油三酯血癥、高密度脂蛋白降低、低密度脂蛋白增加[3]。慢性高血糖和高脂血癥可導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥，長期的高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA含量升高[4]。有研究[5-6]表明糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與活性氧自由基的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激增加有密切關(guān)聯(lián)?？寡鮿┏趸缁?SOD)和終產(chǎn)物丙二醛(MDA)是衡量過氧化反應(yīng)的兩個重要指標(biāo)。

研究[7-9]表明，天然植物多糖大多具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用，其可通過提高SOD等抗氧化物酶活性，減少MDA生成，降低2型糖尿病的TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，從而達到降脂降糖的目的[10]。白簕[Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.]為五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopananx)攀援狀灌木，廣泛分布在華南和華中地區(qū)，如嶺南地區(qū)，本品味苦、辛，性涼[11]。白簕的有效活性成分主要有揮發(fā)油、多糖、黃酮類、皂苷、萜類等，有舒筋活絡(luò)、理氣、解熱鎮(zhèn)痛、解毒、祛風(fēng)除濕和止咳之效[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，白簕中性多糖(ATP1-1)對1型糖尿病模型小鼠具有降糖效果，但其對2型糖尿病小鼠是否具有類似的作用尚未有研究。本研究旨在運用高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病小鼠模型，探索ATP1-1對T2DM小鼠降血糖效果以及其對體內(nèi)脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，為ATP1-1的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈脲佐菌素(STZ，美國sigma公司)；鹽酸二甲雙胍片(石家莊市普利制藥有限公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司)；總蛋白定量測定試劑盒(考馬斯亮藍法)、超氧化物歧化酶測定試劑盒(WST-1)、丙二醛試劑盒(TBA法)、TC試劑盒、TG試劑盒、LDL-C試劑盒、HDL-C試劑盒等均由南京建成科技有限公司提供。白簕摘自廣東恩平市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院副教授劉基柱鑒定為五加屬植物白簕[Acanthopananxtrifoliatus(L.)Merr.]的莖。

1.2 儀器 XW-80A微型旋渦混勻器(上海滬西分析儀器廠)，數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2(常州市澳華儀器有限公司)，分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，LD4-2A離心機(北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司)，血糖試紙和安穩(wěn)型血糖儀(三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司)，SpectraMax190連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.3 白簕多糖(ATP1-1)的提取分離 取干燥的白簕莖適量經(jīng)95%乙醇浸泡數(shù)小時，過濾、加水煎煮、濃縮水提液，加入80%乙醇浸泡數(shù)小時，經(jīng)離心取沉淀物冷凍干燥即得白簕粗多糖ATP。經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離ATP，蒸餾水洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液中多糖含量，收集洗脫液濃縮即得中性多糖ATP1。經(jīng)SephadexG-75凝膠柱分離中性多糖ATP1-1，蒸餾水洗脫，收集洗脫液濃縮，冷凍干燥，即得中性多糖ATP1-1。

1.4 動物 C57BL/6小鼠36只，18～22 g，動物許可證號：SCXK(粵)2018-0002，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心SPF級環(huán)境，實驗過程嚴(yán)格遵循現(xiàn)行的廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)的相關(guān)法律，符合實驗動物倫理。

1.5 方法

1.5.1 動物造模、分組與給藥 普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠7 d，將小鼠隨機分為正常組(n=6)和模型組(n=30)，正常組喂普通飼料，模型組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個月后，小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ 130 mg/kg。注射STZ結(jié)束一周后，禁食不禁水6 h，尾部取血測小鼠空腹血糖值，血糖值>11.1 mmol/L視為造模成功。待模型穩(wěn)定后，將造模成功的24只小鼠按血糖值隨機分為4組(n=6)，分別為模型組、陽性組、ATP1-1低劑量組、ATP1-1高劑量組。陽性組灌胃185 mg/kg二甲雙胍溶液，低、高劑量組分別灌胃40 mg/kg、80 mg/kg ATP1-1溶液，模型組和正常組分別灌胃等體積的雙蒸水，每天給藥1次，連續(xù)8周。期間正常組持續(xù)給予基礎(chǔ)飼料，其余給予高脂高糖飼料，給藥期間自由攝食和飲水，每周稱量并記錄體重。

1.5.2 樣品采集 給藥后第8周，禁食不禁水12 h，稱量各組小鼠體重，眼眶取血，4000 r離心15 min，收集血清于-20 ℃保存。隨后迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈，拭干，稱重，錫紙包裹，液氮保存，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 空腹血糖值 于給藥后的第7、14、21、28、35、42、49、56天，禁食不禁水6 h，尾部取血，測定空腹血糖值。

1.6.2 小鼠糖耐量值 連續(xù)灌胃給藥8周后，禁食不禁水12 h，按2 g/(kg·bw)劑量灌胃葡萄糖，尾部取血測定灌胃葡萄糖后0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、150 min的血糖值，觀察各組小鼠不同時間點的血糖變化。血糖曲線下面積(AUC)按照以下公式計算：

AUC(min·mmol/L)=7.5A+15B+22.5C+45D+45E+15F

(1)

式(1)中：A、B、C、D、E和F分別表示灌胃后0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、150 min的血糖值。

1.6.3 血清和肝臟理化指標(biāo) 血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、胰島素水平和肝組織中的MDA含量、SOD酶活力均根據(jù)試劑盒說明書來測定。

1.7 肝臟組織切片分析 解剖摘取各組小鼠肝臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片制作切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)，進行分析。

2 結(jié)果

2.1 ATP1-1對糖尿病小鼠體重、飲食量以及飲水量的影響 由表1可知，給藥前糖尿病小鼠的體重明顯低于正常組(P<0.01)，飲食量、飲水量高于正常組(P<0.05)；同時各組糖尿病小鼠之間的體重、飲食飲水量均無明顯差異。給藥第8周時，陽性組及ATP1-1高、低劑量組的小鼠體重明顯高于模型組(P<0.05)；與0周時相比，ATP1-1高劑量組及陽性組顯著增加(P<0.05)，說明給藥可有效提高糖尿病小鼠的體重。由圖1a可知，給藥前糖尿病小鼠的飲食量顯著高于正常組(P<0.05)，到第8周時陽性組、ATP1-1高、低劑量組的飲食量明顯低于模型組(P<0.05)，ATP1-1高劑量具有極顯著差異(P<0.01)；ATP1-1高、低劑量組的飲食量接近正常組(P>0.05)。由圖1 b可見，經(jīng)過8周的給藥治療，陽性組及ATP1-1高劑量組的飲水量顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，ATP1-1能夠促使2型糖尿病模型小鼠的體重及飲食飲水量趨于正常。

表1 各組小鼠的體重變化

a.飲食量變化柱狀圖；b.飲水量變化柱狀圖；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01；與正常組相比，#P<0.05，##P<0.01；與第0周相比，△P<0.05，△△P<0.01圖1 各組小鼠飲食量與飲水量的變化圖

2.2 ATP1-1對糖尿病小鼠空腹血糖的作用 空腹血糖值是臨床上判斷糖尿病的基礎(chǔ)指標(biāo)，反映自身胰島β細胞的能力[13]。給藥前，糖尿病小鼠的空腹血糖值均大于16.7 mmol/L，明顯高于正常組。給藥期間，正常組小鼠空腹血糖值穩(wěn)定在正常范圍，模型組小鼠血糖值持續(xù)處于高血糖狀態(tài)，陽性組,ATP1-1高、低劑量組各小鼠血糖水平在給藥后第2周開始有所降低，第4周時顯著低于同期模型組的空腹血糖(P<0.05)，第8周時各給藥組血糖均極顯著性低于模型組(P<0.01)。

2.3 ATP1-1對糖尿病小鼠糖耐量的作用 由圖3a可知，灌胃葡萄糖后各組小鼠血糖均急劇升高，15 min時達到最高值；30 min開始各給藥組血糖值明顯下降，速度快于模型組小鼠，150 min時各給藥組的血糖值降回初始值。由式(1)計算血糖含量曲線下面積(AUC)可知，如圖3b正常組及各給藥組的AUC均顯著低于模型組(P<0.05)，其中高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。AUC反映血糖含量的變化趨勢，且AUC越小代表對葡萄糖耐受能力越好，結(jié)果表明ATP1-1能夠改善2型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，增強對血糖的調(diào)控。

2.4 ATP1-1對糖尿病小鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C及胰島素水平的影響 如表2和圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠的血清TG、TC、LDL-C明顯升高(P<0.01)，HDL-C、血清胰島素明顯降低(P<0.01)。治療8周后，與模型組相比，各給藥組的TC、TG、LDL-C的水平顯著降低，HDL-C、胰島素的水平顯著升高(P<0.05)，且ATP1-1高劑量的效果與二甲雙胍相當(dāng)，表明ATP1-1可明顯改善2型糖尿病小鼠的脂代謝紊亂癥狀，并增加胰島素分泌。

與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

a.灌胃葡萄糖后的血糖變化曲線；b.血糖響應(yīng)曲線下面積(AUC)；與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01圖3 各組小鼠糖耐量及曲線下面積的變化圖

表2 各組小鼠血脂四項的檢測結(jié)果

與模型組比，**P<0.01

2.5 ATP1-1對糖尿病小鼠肝臟SOD酶活性及MDA含量的影響 由圖5a可知，模型組小鼠肝臟SOD酶活性明顯低于正常組(P<0.01),由圖5b可知，MDA含量高于正常組(P<0.05)，這表明2型糖尿病小鼠的肝臟抗氧化能力下降。經(jīng)ATP1-1不同劑量治療8周后，糖尿病小鼠的SOD酶活性均顯著升高(P<0.01)，MDA的含量明顯下降(P<0.05)，其中高劑量效果更優(yōu)。

2.6 ATP1-1對糖尿病小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 由圖6可知，正常組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊緊密，無瘀血等病變現(xiàn)象，而模型組小鼠肝細胞排列紊亂，較多細胞水腫，胞體腫脹，較多細胞空泡變性(如圖中箭頭所示)。與模型組相比，陽性組小鼠肝細胞排列較整齊，形態(tài)有所改善，輕微空泡變性；ATP1-1各劑量組小鼠肝細胞排列較整齊，細胞形態(tài)得到改善，空泡變性減少。以上說明，ATP1-1對2型糖尿病造成的小鼠肝臟損傷有改善修復(fù)作用，且高劑量效果更好。

a.SOD酶活力變化柱狀圖；b. MDA含量變化柱狀圖；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 各組小鼠肝臟的氧化指標(biāo)圖

正常組 模型組 陽性組 ATP1-1高劑量組 ATP1-1低劑量組圖6 小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果圖(×400)

3 討論

研究[14-16]表明，人參、西洋參、刺五加等五加科天然植物多糖在降血糖的同時還具有降血脂的功效。白簕為五加科五加屬植物，在前期研究中發(fā)現(xiàn)其精制多糖ATP1-1具有降低1型糖尿病小鼠血糖的作用，本文采用高脂飼料加注射STZ建立2型糖尿病小鼠模型，進一步發(fā)現(xiàn)ATP1-1在具有降糖功效的同時也可有效降低血脂。

空腹血糖、糖耐量及胰島素水平是判斷糖尿病的重要指標(biāo)，糖耐量用于衡量機體對葡萄糖的耐受能力；胰島素作為體內(nèi)唯一能降血糖的激素，可通過促進靶細胞對葡萄糖的攝取、貯存和利用及對脂肪的合成，抑制糖原及脂肪的分解來降低血糖。當(dāng)攝入大量的葡萄糖后，機體會迅速促進分泌胰島素，使血糖降低至正常范圍。本研究中糖尿病模型組小鼠一直維持高血糖及多飲多食的特征，胰島素水平很低，可見造模后小鼠自身血糖調(diào)節(jié)能力下降，與文獻[17]一致，說明造模成功；給藥后ATP1-1可有效改善糖尿病小鼠的相關(guān)癥狀，提高小鼠對葡萄糖的耐受能力，提高機體胰島素水平，結(jié)合課題組前期結(jié)果[18]，說明ATP1-1對1、2型糖尿病小鼠均有治療作用。

2型糖尿病患者在出現(xiàn)血糖水平異常的同時往往伴有血脂水平代謝的異常[19]，姚欣卉等[20]研究表明2型糖尿病小鼠也會出現(xiàn)與患者相似的臨床癥狀。實驗中發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的TG、TC、LDL-C顯著上升，HDL-C顯著下降，呈現(xiàn)血脂代謝異常的典型特征；經(jīng)ATP1-1治療8周的糖尿病小鼠血脂四項結(jié)果明顯得到了改善，說明ATP1-1對脂代謝紊亂有調(diào)節(jié)作用，具有降血脂作用。

糖尿病的糖脂代謝異常與氧化應(yīng)激水平相關(guān)[21-23]，糖尿病患者體內(nèi)活性氧簇(ROS)過量的產(chǎn)生，可加重胰島素抵抗、引起血糖升高以及胰島細胞抗氧化能力的降低，導(dǎo)致機體氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[24-25]。SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶等抗氧化酶均能降低機體的氧化應(yīng)激水平，從而改善脂代謝異常，其中SOD是關(guān)鍵酶之一；SOD是一種能有效清理超氧自由基減少肝臟損傷的抗過氧化酶，其表達增加能降低機體氧化應(yīng)激，保護胰島β細胞，改善高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗和脂質(zhì)氧化[26]。體內(nèi)過多的自由基常與蛋白質(zhì)、磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)造成不可逆轉(zhuǎn)的修飾與損傷，其作用產(chǎn)生MDA、4羥基壬烯醛等醛類活性產(chǎn)物；MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，能間接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生的水平，對體內(nèi)脂代謝情況有一定的指示意義。本實驗發(fā)現(xiàn)ATP1-1治療后，糖尿病小鼠肝臟內(nèi)的SOD酶活性升高，MDA含量減少，表明該多糖可提高抗氧化酶SOD活性，抑制體內(nèi)過氧化反應(yīng)，從而達到改善脂代謝的目的。

綜上，ATP1-1可降低2型糖尿病模型小鼠的血糖及血脂，改善脂代謝紊亂，該作用與提高體內(nèi)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化有關(guān)。