婁玉穗，尚泓泉，樊紅杰，李 政，張 柯，呂中偉，張曉鋒，吳文瑩

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002；2. 河南中遠葡萄研究所有限公司，河南 鄭州 450045）

陽光玫瑰是目前我國最受歡迎的葡萄品種之一，然而該品種在成熟期會出現(xiàn)果銹癥狀，嚴(yán)重影響其外觀品質(zhì)和商品性[1?2]。果銹是一種生理性病害，表現(xiàn)為在果實表面呈現(xiàn)條狀或不規(guī)則狀黃褐色銹斑，嚴(yán)重時連成片[3?4]。果銹常發(fā)生在梨、蘋果、枇杷和黃綠色的鮮食葡萄品種上[5?7]。

組織學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)生果銹的蘋果和梨果實表皮細胞角質(zhì)層破裂，木栓化程度加深，表皮細胞甚至皮層細胞死亡，且果銹形成的微觀結(jié)構(gòu)變化早于外觀變化[8?10]。與抗銹蘋果品種相比，感銹品種的果實表皮細胞排列松散、無序、細胞壁薄，且發(fā)生果銹部位的表皮角質(zhì)層和蠟質(zhì)層薄，沒有規(guī)則，易破裂[8]。SUEHIRO 等[3]在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，陽光玫瑰葡萄果銹的褐變部位位于表皮細胞組織內(nèi)，褐變物質(zhì)位于果皮的細胞間隙和細胞壁上，而關(guān)于陽光玫瑰葡萄果銹產(chǎn)生過程的組織結(jié)構(gòu)變化尚未見報道。王慧等[4]在翠冠梨上的觀察發(fā)現(xiàn)，果銹主要是破碎的角質(zhì)膜、木質(zhì)化加厚的表皮和亞表皮細胞以及果點上較易剝落的物質(zhì)。張鵬飛[11]的研究表明，與無銹梨相比，有銹梨果皮木質(zhì)素含量升高，角質(zhì)含量減少，木栓質(zhì)含量增加。還有研究表明，赤霉素和氯吡脲處理降低陽光玫瑰葡萄果銹發(fā)生程度與果皮中木質(zhì)素和總酚含量的降低有關(guān)[12]。另外，在蘋果和梨的研究中還發(fā)現(xiàn)，果銹發(fā)生伴隨著苯丙烷代謝、酚類物質(zhì)代謝等次生代謝的發(fā)生[13?14]，且苯丙氨酸解氨酶與過氧化物酶是梨果皮木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶[15]。HOU 等[16]研究表明，赤霉素和氯吡脲處理會降低陽光玫瑰葡萄苯丙氨酸解氨酶活性，從而降低果銹的發(fā)生。因此，研究不同果銹等級的陽光玫瑰葡萄果皮組織結(jié)構(gòu)、細胞膜透性、果皮結(jié)構(gòu)物質(zhì)及相關(guān)酶活性變化，旨在探明陽光玫瑰葡萄果銹形成的生理機制，為果銹防治技術(shù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地（35.0°N、113.7°E）進行。以8年生陽光玫瑰葡萄植株為試驗材料，貝達砧，南北行向，株行距1.5 m×3.0 m，高寬垂架式，簡易避雨栽培。花果管理和肥水管理參考婁玉穗等[17]的方法進行，于見花時修整花穗，留穗尖6 cm，盛花后1～3 d（2019 年5 月11—13 日）分批次用25 mg/L GA3（赤霉酸）+2 mg/L CPPU（氯吡脲）進行?；ū９幚?，14 d 后用25 mg/L GA3進行膨大處理。在果粒黃豆粒大小時疏果至60粒左右，控制單穗質(zhì)量700 g左右。

1.2 果銹發(fā)生率的調(diào)查

從果實進入軟化期后（8月7日，盛花后90 d）開始調(diào)查陽光玫瑰葡萄果銹發(fā)生率，每10 d 調(diào)查一次，直至10 月16 日（盛花后160 d），每次調(diào)查15 串果穗。調(diào)查方法：調(diào)查并記錄每串果穗上有果銹的果粒數(shù)量和果穗上總果粒數(shù)量，計算果粒果銹發(fā)生率，果銹發(fā)生率=有果銹果粒數(shù)量/總果粒數(shù)量×100%。

1.3 果皮組織結(jié)構(gòu)的觀察

果實進入軟化期后（8月15日、9月20日），采集有果銹和無果銹的果粒樣品，帶回實驗室。按照果銹發(fā)生程度將果粒分成輕度果銹（果銹面積≤5%）、中度果銹（果銹面積6%～25%）和重度果銹（果銹面積>25%）3 個等級。利用體視顯微鏡（M205A，Leica）觀察不同等級的果粒果皮組織結(jié)構(gòu)。光學(xué)顯微鏡觀察：取不同果銹程度的果粒，用刀片在果皮上切1 cm2左右，然后用鑷子輕輕夾起果皮，放到載玻片上，滴上一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，放到顯微鏡（ECLIPSE E100，Nikon）下觀察果皮組織結(jié)構(gòu)特征[18]。

1.4 果皮細胞膜相對滲透率、細胞壁成分與果銹物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的測定

在果實成熟期（9 月16 日），采集有果銹和無果銹的果粒樣品，參考馮嬌等[19]的方法對果粒進行等級劃分，即0級：沒有果銹；1級：果銹面積≤5%；2級：果銹面積6%～15%；3 級：果銹面積16%～25%；4 級：果銹面積>25%。

1.4.1 果皮細胞膜相對滲透率 采用電導(dǎo)儀法測定果皮細胞膜相對滲透率。首先用去離子水清洗果粒，用吸水紙吸干，然后用直徑為8 mm 的打孔器打取不同果銹等級的果皮，用鑷子夾取果皮放到吸水紙上吸取果皮內(nèi)側(cè)果汁，每個等級的果皮樣品打取20 個小圓片，接著放入試管中，加入15 mL 去離子水，室溫下?lián)u床振蕩浸泡1 h，測定電導(dǎo)率；之后在100 ℃沸水浴中煮沸10 min，冷卻至常溫后測定電導(dǎo)率；計算果皮細胞膜相對滲透率，細胞膜相對滲透率=煮沸前的電導(dǎo)率/煮沸后的電導(dǎo)率×100%。

1.4.2 果皮細胞壁成分與果銹物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性 用鑷子分別夾取5 個果銹等級的果皮樣品，然后用液氮進行快速冷凍，之后用冷凍研磨儀（A11 basic，德國IKA/艾卡）進行研磨粉碎，粉碎樣品用于以下指標(biāo)的測定。纖維素含量采用蒽酮比色法測定，半纖維素含量采用DNS 比色法測定，原果膠含量采用咔唑比色法測定，木質(zhì)素含量采用紫外分光光度法測定，總酚含量采用Folin-Ciocalteu 試劑法測定[19]。纖維素酶活性采用蒽酮比色法測定，酸性磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉水解法測定，果膠酶、堿性磷酸酶和苯丙氨酸解氨酶活性采用吸光法測定，過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，多酚氧化酶活性采用鄰苯二酚法測定[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010 軟件進行整理和繪圖，用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同掛樹時間對陽光玫瑰葡萄果銹發(fā)生率的影響

如圖1所示，隨著果實的成熟，果銹發(fā)生率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。在所調(diào)查的時間中，盛花后90 d 的陽光玫瑰葡萄果銹發(fā)生率最低，為3.3%；盛花后100 d和110 d的果銹發(fā)生率之間差異不顯著，且盛花后100 d 的果銹發(fā)生率顯著低于盛花后120 d 及之后時間調(diào)查的果銹發(fā)生率；盛花后130 d 的果銹發(fā)生率達到最大值，為20.0%，其與盛花后120 d 及之后時間的果銹發(fā)生率之間差異均不顯著。

圖1 不同掛樹時間對陽光玫瑰葡萄果銹發(fā)生率的影響Fig.1 Effect of days after full bloom on berry russet rate of Shine Muscat grape

2.2 陽光玫瑰葡萄果銹組織結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 體式顯微鏡的觀察結(jié)果 從圖2 可以看出，輕度果銹僅在果皮表面出現(xiàn)褐色不規(guī)則斑塊，細胞壁褐化，使得細胞結(jié)構(gòu)凸顯（圖2A、2B）；中度果銹的果皮上褐色斑塊增大，果銹位置呈現(xiàn)凹凸不平的狀態(tài)（圖2C、2D）；重度果銹的果皮褐化程度加深，甚至呈現(xiàn)黑褐色，果皮上凹凸不平的組織連成片，部分細胞全部褐化壞死（圖2E、2F）。

圖2 體式顯微鏡下陽光玫瑰葡萄果皮果銹特征Fig.2 The characteristics of berry russet of Shine Muscat grape under stereomicroscope

2.2.2 光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果 從圖3 可以看出，沒有發(fā)生果銹的果皮細胞排列整齊，細胞顏色均勻，細胞結(jié)構(gòu)完整（圖3A）。在果銹發(fā)生初期（軟化期），輕度果銹的果皮細胞壁和細胞間隙呈褐色，細胞內(nèi)部顏色不變（圖3B）；中度果銹的果皮褐化范圍增大（圖3C）。在果銹發(fā)生后期（成熟期），輕度果銹的果皮褐色物質(zhì)向細胞內(nèi)部蔓延且凹陷，細胞間隙增大，褐化范圍增加（圖3D）；中度和重度果銹的果皮上褐化細胞數(shù)量增多，且部分細胞內(nèi)部全部褐化，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞（圖3E、3F）。

圖3 光學(xué)顯微鏡下陽光玫瑰葡萄果皮果銹特征Fig.3 The characteristics of berry russet of Shine Muscat grape under optical microscope

2.3 不同果銹等級對陽光玫瑰葡萄果皮細胞膜相對滲透率的影響

如圖4所示，隨著果銹等級的增加，果皮細胞膜相對滲透率增大，說明細胞膜受到破壞的程度增大。果銹等級0、1 和2 的果皮細胞膜相對滲透率分別為67.9%、69.8%、70.8%，三者之間差異不顯著，且均顯著小于果銹等級3 和4 的果皮細胞膜相對滲透率；果銹等級3 和4 的果皮細胞膜相對滲透率分別為77.1%和80.4%，兩者之間差異不顯著，說明果銹等級3及以上的果皮細胞膜受到較嚴(yán)重破壞。

圖4 陽光玫瑰葡萄果銹等級與果皮細胞膜相對滲透率之間的關(guān)系Fig.4 Relationship of berry russet level and relative permeability of cell membrane in Shine Muscat grape peel

2.4 不同果銹等級對陽光玫瑰葡萄果皮細胞壁和果銹相關(guān)物質(zhì)含量的影響

從表1可知，隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮的纖維素、半纖維素、原果膠含量呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，而木質(zhì)素和總酚含量呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢。其中，沒有發(fā)生果銹的果皮纖維素含量為330.7 mg/g，其顯著高于所有發(fā)生果銹的果皮纖維素含量；果銹等級1 和2 的果皮纖維素含量分別為315.8 mg/g 和309.3 mg/g，兩者之間差異不顯著，且果銹等級1 的果皮纖維素含量顯著高于果銹等級3 和4 的果皮纖維素含量；果銹等級3 和4 的果皮纖維素含量之間差異顯著。在果皮半纖維的含量上，果銹等級0 和1 的半纖維素含量之間差異不顯著，且兩者均顯著高于果銹等級2、3 和4 的果皮半纖維素含量；果銹等級2 和3 的果皮半纖維素含量分別為64.3 mg/g 和61.3 mg/g，兩者之間差異不顯著，且均顯著高于果銹等級4的果皮半纖維素含量。果銹等級0 的果皮原果膠含量為74.9 mg/g，其顯著高于果銹等級3 和4 的果皮原果膠含量；果銹等級1、2 和3 的果皮原果膠含量之間差異均不顯著，且三者均顯著高于果銹等級4 的果皮原果膠含量；果銹等級4的果皮原果膠含量為62.9 mg/g。

表1 不同果銹等級的陽光玫瑰葡萄果皮細胞壁及果銹相關(guān)物質(zhì)含量的變化Tab.1 Changes in related substances of cell wall and berry russet of different berry russet levels in Shine Muscat grape peel mg/g

沒有發(fā)生果銹的果皮木質(zhì)素含量為156.8 mg/g，其顯著低于所有發(fā)生果銹的果皮木質(zhì)素含量；果銹等級1 和2 的果皮木質(zhì)素含量分別為161.3 mg/g 和164.0 mg/g，兩者均顯著低于果銹等級3 和4 的果皮木質(zhì)素含量；果銹等級3 和4 的果皮木質(zhì)素含量分別為170.3 mg/g 和175.9 mg/g，兩者之間差異顯著。果銹等級4 的果皮總酚含量為1.47 mg/g，其顯著高于其他所有等級的果皮總酚含量；果銹等級2 和3的果皮總酚含量均為1.37 mg/g，兩者均顯著高于果銹等級0和1的果皮總酚含量；果銹等級1的果皮總酚含量顯著高于果銹等級0的果皮總酚含量。

2.5 不同果銹等級對陽光玫瑰葡萄果皮相關(guān)酶活性的影響

在與細胞壁降解相關(guān)酶中（表2），隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮的纖維素酶、酸性磷酸酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，果膠酶活性整體上呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢。5個果銹等級的果皮纖維素酶活性之間差異均顯著，其中，果銹等級3的果皮纖維素酶活性最高，為1 665.63μg/（min·g），果銹等級4 的果皮纖維素酶活性介于果銹等級0 與1 之間，果銹等級0 的果皮纖維素酶活性最低。果銹等級0的果皮果膠酶活性最低，為1.11 mg/（h·g），其顯著低于其他所有等級的果皮果膠酶活性；果銹等級4的果皮果膠酶活性最高，為7.93 mg/（h·g），其顯著高于其他所有等級的果皮果膠酶活性；果銹等級1 和3 的果膠酶活性之間差異不顯著，且均顯著低于果銹等級2 的果皮果膠酶活性。果銹等級2 的果皮酸性磷酸酶活性最高，為1.215μmol/（min·g），其與果銹等級3的果皮酸性磷酸酶活性之間差異不顯著，但顯著高于其他等級的果皮酸性磷酸酶活性；果銹等級1 與3 的果皮酸性磷酸酶活性之間差異不顯著，且均顯著高于果銹等級0 和4 的果皮酸性磷酸酶活性；果銹等級4 的果皮酸性磷酸酶活性最低。果銹等級2 的果皮堿性磷酸酶活性最低，為10.180μmol/（min·g），其顯著低于果銹等級0、3和4的果皮堿性磷酸酶活性；果銹等級4 的果皮堿性磷酸酶活性最高，為12.696 μmol/（min·g），其顯著高于其他所有等級的果皮堿性磷酸酶活性；果銹等級3與0的果皮堿性磷酸酶活性之間差異不顯著。

表2 不同果銹等級的陽光玫瑰葡萄果皮相關(guān)酶活性的變化Tab.2 Changes in related enzyme activities of different berry russet levels in Shine Muscat grape peel

在果銹物質(zhì)合成相關(guān)酶中，隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮苯丙氨酸解氨酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，過氧化物酶活性呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，多酚氧化酶活性呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢。5 個果銹等級的果皮苯丙氨酸解氨酶活性之間差異均顯著，其變化范圍為8.205～11.354 U/g。果銹等級0、1 和2 的果皮過氧化物酶活性之間差異均不顯著，三者均顯著低于果銹等級3 和4 的果皮過氧化物酶活性；果銹等級3 和4 的果皮過氧化物酶活性分別為60.553 U/g和68.060 U/g，兩者之間差異顯著。5個果銹等級的果皮多酚氧化酶活性之間差異均顯著，其變化范圍為4.787～12.880 U/g。

3 結(jié)論與討論

果銹是果實發(fā)育過程中的一種生理紊亂現(xiàn)象，在無核白雞心、維多利亞、陽光玫瑰等黃綠色葡萄品種上經(jīng)常發(fā)生[1，7]，成為降低其商品性的主要因素之一。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陽光玫瑰葡萄在生長前期沒有果銹發(fā)生，進入軟化期后才會有果銹發(fā)生，且隨著果實的成熟，果銹發(fā)生率越來越高，這與之前的研究結(jié)果相似[1，11，19]。果銹的發(fā)生主要是次生代謝的結(jié)果[13?14]，果實的次生代謝主要發(fā)生在果實發(fā)育后期[21]，這也是造成果銹主要在近果實成熟期發(fā)生的主要原因。

袁高鵬[22]在金冠蘋果果銹形成過程的觀察發(fā)現(xiàn)，在果銹發(fā)生初期，果皮開始形成微裂隙，表皮細胞開始破裂，之后微裂隙進一步加深，形成V 形裂痕，果銹成分開始積累，最后V 形裂縫變得更長、更深，果銹成分大量沉積。陽光玫瑰葡萄果銹的發(fā)生過程與之不同，日本島根農(nóng)技研報[23]的報道表明，陽光玫瑰葡萄果銹的褐變部位位于表皮細胞組織內(nèi)，以細胞間隙為中心，或是在亞表皮細胞層中被發(fā)現(xiàn)，且褐變部位正上方的表皮細胞層變薄，果皮表面呈現(xiàn)出凹凸不平的狀態(tài)。SUEHIRO等[3]的研究也表明，陽光玫瑰葡萄果銹的褐變部位位于表皮細胞組織內(nèi)，褐變物質(zhì)位于果皮的細胞間隙。本研究結(jié)果與之相似，陽光玫瑰葡萄果銹首先發(fā)生在細胞間隙和細胞壁上，細胞結(jié)構(gòu)凸顯；隨著發(fā)生程度的增加，果銹物質(zhì)逐漸向細胞內(nèi)部蔓延，褐化范圍和細胞間隙增大，果皮表面呈現(xiàn)凹凸不平的狀態(tài)；果銹嚴(yán)重時褐化物質(zhì)滲透整個細胞，使細胞壞死。

植物細胞膜是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外物質(zhì)交流的屏障，同時對維持細胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以致植物細胞浸提液的電導(dǎo)率增大[24?25]。本研究中，隨著果銹發(fā)生程度的增加，陽光玫瑰葡萄果皮細胞膜的相對滲透率逐漸增加，且果銹等級3 和4 的果皮細胞膜的相對滲透率顯著升高，說明果銹等級3 及以上等級的果皮細胞膜遭到嚴(yán)重破壞，細胞膜透性增大的程度與果銹發(fā)生程度密切相關(guān)。

纖維素是細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，對于維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用；半纖維素是構(gòu)成初生壁的主要成分，其結(jié)合在纖維素微纖維的表面，構(gòu)成堅硬的細胞相互連接的網(wǎng)絡(luò)[26]。果膠是構(gòu)成細胞初生壁和中膠層的主要成分，對維持植物的結(jié)構(gòu)和硬度起著重要作用[27]。張勃[28]在黃冠梨上的研究表明，果皮中果膠物質(zhì)含量的增高及纖維素含量的降低可以提高果皮韌性和延展性，增大果皮破裂應(yīng)力，從而抑制果實銹斑的發(fā)生。本研究中，隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮纖維素、半纖維素和原果膠含量逐漸降低，且三者含量開始顯著降低時的果銹等級分別為1、2 和3，說明陽光玫瑰葡萄果銹的發(fā)生首先是細胞壁的骨架—纖維素的快速降解，然后是纖維素微纖維間的網(wǎng)絡(luò)—半纖維素的快速降解，最后是原果膠的快速降解，這種變化與纖維素酶和果膠酶的活性變化相一致。隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮的纖維素酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，果膠酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，其中，果銹等級4的果皮纖維素酶活性的降低說明此時果皮纖維素的降解減慢，也間接說明果銹等級1～3 的果皮纖維素降解較快，從而造成果實一開始發(fā)生果銹便出現(xiàn)纖維素含量顯著下降的變化；而果膠酶活性的持續(xù)升高說明原果膠是在果膠酶活性達到一定水平后才顯著降解，從而造成果銹發(fā)生后期果皮的原果膠含量顯著降低。

果銹是一層褐色的木栓化次生保護組織，木栓層的形成與木質(zhì)素、酚類物質(zhì)含量有關(guān)[8，19]。本研究結(jié)果表明，隨著陽光玫瑰葡萄果銹等級的增加，果皮木質(zhì)素、總酚含量逐漸增加，這與果皮組織結(jié)構(gòu)觀察的果皮褐化程度的增加相一致，也與馮嬌[12]的研究結(jié)果相似，說明陽光玫瑰葡萄果銹的發(fā)生伴隨著果皮中木質(zhì)素和總酚含量的增加。木質(zhì)素是苯丙烷類代謝途徑的主要終產(chǎn)物，是木栓層形成、果實木質(zhì)化的標(biāo)志[29]。木質(zhì)素是在多個酶促反應(yīng)的作用下合成的，苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等均在木質(zhì)素的合成過程中起著重要作用[13，15]，其中，過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶是調(diào)控蘋果、梨果實銹斑產(chǎn)生的關(guān)鍵酶[13，28，30]，且WANG等[31]的研究表明，蘋果苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶活性的降低與表皮細胞木質(zhì)素合成的減少密切相關(guān)，曹愛娟等[32]的研究表明，當(dāng)苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶活性達到一個相對高的水平后，桃果皮木質(zhì)素才開始快速積累。本研究中，隨著果銹等級的增加，陽光玫瑰葡萄果皮的苯丙氨酸解氨酶活性逐漸升高，說明苯丙氨酸解氨酶活性與木質(zhì)素的合成呈正相關(guān)，這與NAZARI 等[33]的研究結(jié)果一致，而與ASSIS 等[34]的研究結(jié)果相反，其研究中苯丙氨酸解氨酶活性的增加不能促進毛葉番荔枝果實木質(zhì)素的合成。之前還有研究表明，枇杷皮的木質(zhì)素合成與過氧化物酶活性密切相關(guān)[35]，而本研究中，過氧化物酶活性隨果銹等級的增加表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢，而多酚氧化酶活性表現(xiàn)出逐漸降低的變化趨勢，這與HOU 等[16]的研究結(jié)果相似，其研究中陽光玫瑰葡萄果皮木質(zhì)素的合成與過氧化物酶、多酚氧化酶活性的增加不一致，說明這2種酶不是調(diào)控陽光玫瑰葡萄果皮木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶。