成 雪，張永萍,2,3*，徐 劍,2,3，楊芳芳,2，劉 耀,2,3

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽 550025) 2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心(貴州 貴陽 550025) 3.國家苗藥工程技術(shù)研究中心(貴州 貴陽 550025)

苗醫(yī)藥是祖國極具民族特色的文化瑰寶，苗藥弩藥源自古代苗人射殺動物涂于弓箭上的劇毒藥物，起效快，有“見血封喉”之效[1]。后世經(jīng)減毒后，與針合用，稱為弩藥針，常用于風(fēng)濕疾病的治療。貴州畢節(jié)與黔東南地區(qū)仍有使用[2-3]。由于苗族無特定文字，弩藥方的記載較少，僅以古歌、傳說、神話故事等形式口傳心授[1]，這使弩藥方的組成各不相同。為了固定苗藥弩藥組方，本研究以均勻設(shè)計試驗結(jié)合經(jīng)典的鎮(zhèn)痛抗炎試驗進行組方配伍篩選，為苗藥弩藥方的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物KM雄性小鼠，18～22 g；SD大鼠，雄性，180～250 g(重慶騰鑫實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(軍)2018-0011)。給予充足的水和鼠料，自由飲水攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2藥物試劑與儀器川烏、草烏、天南星等藥材(購于貴陽市花果園太升藥材市場)；50%乙醇(實驗室自制)；扶他林(批號：VP1235，北京諾華制藥有限公司)；硫化鈉(批號：2018050106，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(批號：20180727，重慶江川化工有限公司)；二甲苯(批號：20181101，重慶川東化工有限公司)。智能熱板儀(BHS-6B，北京中慧天誠科技有限公司)；游標卡尺(上海量具刃具廠)。

1.3方法

1.3.1 均勻設(shè)計 以專著和期刊中報道的弩藥組方為依據(jù)，統(tǒng)計分析各藥味頻數(shù)，見表1。

頻數(shù)最多的10味藥為：生草烏、川烏、天南星、半截爛、雪上一枝蒿、八角楓、三分三、蜂毒(蜂房、馬蜂窩、大馬蜂)、半夏及麝香，其中，蜂毒和麝香為貴重藥材，不易獲得。為固定弩藥組成，以臨床常用方(處方6)為基礎(chǔ)，配以專著和期刊中頻次多的藥味為備選藥物。選擇的藥物類別為：生草烏、八角楓、黑骨藤、大血藤、透骨香、川烏、天南星、半截爛、三分三、雪上一枝蒿。

用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，選擇U11(1110)均勻設(shè)計表，以生草烏、川烏、天南星等10味藥為因素，各設(shè)11個水平，設(shè)置初始量為0 g，最大量是常用量的2倍，以第6個水平為每味藥常用量[11-13]。按照U11(1110)均勻設(shè)計表安排試驗，得不同配伍弩藥11組，見表2。按試驗安排表，稱取各藥物，用1 200 mL 50%乙醇密封浸泡30 d，每天振搖3次，過濾，定容至1 000 mL，置于陰涼避光處備用。

1.3.2 抗炎鎮(zhèn)痛實驗

1.3.2.1 小鼠醋酸扭體實驗 小鼠喂養(yǎng)1周后，隨機分為14組，每組8只，分別為溶劑對照組、空白組、均勻設(shè)計組(N1～N11)，陽性組。8%硫化鈉小鼠腹部脫毛，N1～N11組涂藥(0.1 mL/只)[7]至腹部，陽性組在腹部涂抹芝麻粒大小的軟膏，溶劑對照組給予50%乙醇，空白組不做處理，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后腹腔注射0.6%冰醋酸(0.2 mL/只)，觀察小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)及潛伏時間，計算各組鎮(zhèn)痛百分率[14]，比較各組扭體次數(shù)和潛伏時間差異。

1.3.2.2 小鼠熱板法實驗 實驗前測定小鼠基礎(chǔ)痛閾值(小鼠起始在熱板儀上到舔后足的時間，痛閾值應(yīng)在5～30 s內(nèi)為合格)，選取合格小鼠，隨機分為14組，分組按1.3.2.1項方法。N1～N11組取5 mL藥液至鼠籠，潤濕籠底，取4只小鼠放至同一籠中，30 min后放回原鼠籠；陽性藥組4足涂抹芝麻粒大小的扶他林軟膏，1次/1 d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后，溶劑對照組給予50%乙醇，空白組不做處理。測定小鼠30、60、90 min的平均痛閾值，計算各組痛閾提高率，比較各組間痛閾值差異。

痛閾提高率=(給藥后痛閾值-基礎(chǔ)痛閾值)/基礎(chǔ)痛閾值×100%。

鎮(zhèn)痛百分率=(溶劑組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/溶劑組扭體次數(shù)×100%。

1.3.2.3 雞蛋清致炎實驗 分組按1.3.2.1項方法。將脫脂棉(2 cm×2 cm)用膠布固定于大鼠右后腳掌，N1～N11組取0.7 mL藥液吸附于脫脂棉上，觀察大鼠防其咬掉脫脂棉，1 h后拆掉[15]，陽性組在足部涂抹芝麻粒大小的扶他林軟膏，溶劑對照組給予50%乙醇，空白組不做處理。給藥后立即測大鼠右后足的厚度，為致炎前足厚度[9]。30 min后足皮下注射10%新鮮雞蛋清溶液(0.2 mL/只)致炎，分別在致炎0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h測右后足厚度，計算致炎前后差值即為足腫脹度，比較各組差異。

1.3.2.4 二甲苯致耳腫脹實驗 分組按1.3.2.1項方法。N1～N11組小鼠均勻涂藥(0.1 mL/只)于左耳，陽性組在左耳涂抹芝麻粒大小的扶他林軟膏，溶劑對照組給予50%乙醇，空白組不做處理。1次/1d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，取二甲苯(0.05 mL/只)涂于左耳致炎。30 min后，小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪取兩耳，于同一位置用8 mm打孔器取兩側(cè)耳片，稱重，兩耳差值為腫脹度[16]，比較各組腫脹度差異，并計算抑制率。

抑制率=(空白組腫脹度-給藥組腫脹度)/空白組腫脹度×100%。

2 結(jié)果

2.1小鼠醋酸扭體法實驗與空白組比較，陽性組與均勻設(shè)計各組(N1～N11)小鼠的扭體次數(shù)明顯減少(P<0.05)；均勻設(shè)計組(N1～N7)小鼠在潛伏時間上明顯延長(P<0.05)。與溶劑對照組比較，均勻設(shè)計各組(N1～N8，N10)小鼠的扭體次數(shù)明顯減少(P<0.05)；均勻設(shè)計組(N1～N7)小鼠在潛伏時間上明顯延長(P<0.05)。陽性組、均勻設(shè)計各組(N1～N11)鎮(zhèn)痛率均在一定程度上提高了小鼠鎮(zhèn)痛率，見表3。

2.2小鼠熱板法實驗與空白組比較，30 min時，陽性組、N6組、N7組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.05)；60 min時，陽性組、N6組、N9組、N10組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.05)；90 min時，陽性組、N2組、(N5～N10)組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.05)。與溶劑對照組比較，30 min時，陽性組、N7組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.01)；60 min時，陽性組、N6組、N9組、N10組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.01)；90 min時，陽性組、N9組、N10組小鼠痛閾值明顯提高(P<0.01),見表4。

2.3雞蛋清致炎實驗與空白組比較，30 min時，陽性組與均勻設(shè)計組(N1～N11)大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；1 h時，陽性組與均勻設(shè)計各組(N1～N9)組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；2 h時，陽性組、N1組、N2組、N4組、N7組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.01)；3 h時，陽性組、N1組、N2組、N7組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；4 h時，陽性組、N1組、N2組、N5組、N7組、N8組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)。與溶劑對照組比較，30 min時，陽性組與均勻設(shè)計各組(N1～N9)、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；1 h時，陽性組與均勻設(shè)計各組(N1～N8)組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；2 h時，陽性組、N1組、N2組、N4組、N7組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；3 h時，陽性組、N1組、N2組、N7組、N8組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)；4 h時，陽性組、N1組、N2組、N5組、N7組、N8組、N11組大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05)，見表5。

2.4二甲苯致耳腫脹實驗與空白組比較，陽性組、N1組、(N3～N5)組、(N7～N11)組小鼠耳腫脹明顯緩解(P<0.05)；與溶劑對照組比較，陽性組、N1組、(N3～N5)組、(N7～N8)組、(N10～N11)組小鼠耳腫脹明顯緩解(P<0.05),見表6。

2.5加權(quán)評分結(jié)果以耳腫脹度Y1、醋酸扭體次數(shù)Y2、足腫脹度Y3和痛閾值Y4為綜合評價指標，進行加權(quán)綜合評分,見表7。計算公式如下：

Y1=(YR1-YN1)/(YR1-YN1)max×100%；

Y2=(YR2-YN2)/(YR2-YN2)max×100%；

Y3=1/5(Y0.5 h+Y1 h+Y2 h+Y3 h+Y4 h)，

Y0.5 h/1 h/3 h/4 h=(YR3-YN3)/(YR3-YN3)max×100%)；

Y4=1/3(Y30+Y60+Y90)，

Y30/60/90=YN4/(YN4)max；

Y=1/4(Y1+Y2+Y3+Y4)。

結(jié)果表明：以DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)逐步回歸分析綜合評分數(shù)據(jù)，得回歸方程：Y=57.671 991 1+0.445 368 289X1-0.140 327 751X2+0.095 357 462 8X3-0.228 722 341 1X4+0.718 831 448X5+0.650 425 895X6+0.061 4034 144X7+0.002 562 459 527X8+0.172 127 995 9X9-0.448 228 119X10；相關(guān)系數(shù)r=0.999 999，P=0.003 5，見表8。根據(jù)回歸方程，綜合評分的最佳藥物組成為：三分三20 g、川烏40 g、天南星40 g、雪上一枝蒿20 g、八角楓30 g、透骨香100 g、半截爛40 g。

3 討論

本文對已有專著和期刊報道的弩藥方進行整合，以均勻設(shè)計法設(shè)計出11組不同配伍的弩藥組方；將11組不同的弩藥組方用50%乙醇浸泡，得到不同的弩藥液后，結(jié)合實驗室常用的經(jīng)典鎮(zhèn)痛抗炎實驗，即醋酸扭體法、熱板法實驗、雞蛋清致炎實驗、二甲苯致耳腫脹實驗篩選弩藥方；最后以耳腫脹度、醋酸扭體次數(shù)、足腫脹度和痛閾值4個指標為綜合評價指標，進行加權(quán)綜合評分，得到最佳弩藥處方。

根據(jù)現(xiàn)有的相關(guān)文獻和專著報道，弩藥由多種毒性中藥組成，本研究篩選出的弩藥最佳處方：三分三、川烏、天南星、雪上一枝蒿、八角楓、透骨香、半截爛，都是毒性中藥。故還應(yīng)致力于研究其如何增效減毒，進一步確定弩藥作用的有效成分，改善劑型，提高安全性，以便于臨床使用。