龍琴 綜述 吳發(fā)印，夏鵬 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是來源于外分泌腺的惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的22%，是涎腺第二大惡性腫瘤，易沿周圍神經(jīng)和血管侵襲，局部復(fù)發(fā)率高，可通過血性轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肺部等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]。治療方法早期以手術(shù)切除后輔助局部放療為主。因其特殊的生物學(xué)行為，晚期轉(zhuǎn)移性頭頸ACC的治療目前尚無明確的治療方案，化療仍是一線治療手段，但其治療價(jià)值仍存在爭(zhēng)論[3-5]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和 基 底 膜(basement membrane，BM)是腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的重要屏障。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中，是一類由核心蛋白和(乙酰)硫酸肝素(heparan sulfate，HS)多糖鏈組成的蛋白多糖的總稱，通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和血管生成的信號(hào)通路，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE，HPA)是新近發(fā)現(xiàn)并克隆出來的一種內(nèi)切糖苷酶，可降解糖氨聚糖中的HS側(cè)鏈，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。而關(guān)于HPSE在ACC中的表達(dá)、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系國內(nèi)外報(bào)道較少。本文就鮮有文獻(xiàn)對(duì)HPSE在ACC中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 HPSE的基因定位及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

1975年H??K及其同事在鼠肝臟組織中首次發(fā)現(xiàn)HPSE是一種降解HS側(cè)鏈的內(nèi)切糖苷酶[7]。直至1997年VLODAVSKY等[8]從人肝癌及胎盤中分離純化50 kDa HPSE，并報(bào)道克隆了編碼這種酶的cDNA和基因。人類HPSE有兩種亞型HPSE1和HPSE2，其中HPSE1是目前腫瘤研究的主要內(nèi)容，HPSE-2與HPSE-1具有約40%的相似性，但發(fā)揮的活性卻不同[9]。在人類中，乙酰肝素酶由單拷貝HPSE基因編碼，該基因位于染色體4q21.3[10]上并通過選擇性剪接表達(dá)為兩種mRNA種類，分別是5 kb和1.7 kb[11]。后續(xù)學(xué)者們對(duì)HPSE進(jìn)行了更為詳細(xì)的研究。HPSE是一種內(nèi)切-β-葡萄糖醛酸酶，屬于糖苷水解家族79，來自糖苷水解家族A。該酶通過水解葡萄糖醛酸(GlcUA，G)和α-D-葡糖胺(GlcN，N)殘基之間的β-1,4-糖苷鍵來降解HS。所有HPSE的三維結(jié)構(gòu)一直難以捉摸，但二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和建模表明(α/β)8 TIM桶折疊，桶的一側(cè)有一個(gè)活性位點(diǎn)裂縫[12]，以及兩個(gè)假定的關(guān)鍵人類HPSE的定位活性位點(diǎn)殘基：Glu225和Glu343，位于活性位點(diǎn)裂隙內(nèi)[13]。最近，VINADER等[14]建立了一種新的人肝素酶同源性模型，并提出了底物與酶的結(jié)合模式和關(guān)鍵結(jié)合元素，以及參與催化的必需活性位點(diǎn)氨基酸殘基。HPSE在幾乎所有人類腫瘤中都過表達(dá)，并且在其過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力之間觀察到相關(guān)性。因此，HPSE被認(rèn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義，也使其成為抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的理想靶點(diǎn)。

2 HPSE與腫瘤的關(guān)系

2.1 HPSE與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移 腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多因素、多步驟的綜合過程。包括癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，侵襲周圍組織，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，逃避免疫監(jiān)視，形成腫瘤血管，在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。在轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)關(guān)鍵而必需的步驟就是腫瘤細(xì)胞穿越ECM和BM形成的天然屏障，侵襲周圍組織及血管。ECM作為一種細(xì)胞分泌組裝的蛋白質(zhì)和多糖的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅能為細(xì)胞提供附著位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)支持，還可以為調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和器官、組織功能提供重要的生物信息[15]。HPSE通過切斷ECM細(xì)胞表面的HS側(cè)鏈，使附著在SDC1上的相關(guān)生物活性分子被釋放出來，形成HPSE/SDC1軸，驅(qū)動(dòng)生長因子信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，并重塑ECM，促進(jìn)了惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[16]。在很多腫瘤組織中，HPSE的mRNA和蛋白均呈高表達(dá)，而在腫瘤周圍正常組織中檢測(cè)不到。HPSE存在的細(xì)胞更易于被轉(zhuǎn)移性腫瘤和免疫細(xì)胞入侵[17]。而沉默HPSE基因可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與HPSE蛋白或基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.2 HPSE與惡性腫瘤的關(guān)系 大量研究顯示HPSE在胃癌[18]、結(jié)腸癌[19]、胰腺癌[20]、膀胱癌[21]和宮頸癌[22]中高表達(dá)，并與腫瘤浸潤、高淋巴轉(zhuǎn)移、高遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高微血管密度和預(yù)后差有關(guān)。幽門螺桿菌感染是胃惡性腫瘤最重要的危險(xiǎn)因素，一些研究表明，幽門螺桿菌感染通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)導(dǎo)致胃腺癌的發(fā)生。一旦激活，MAPK就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活，如NF-κB。最近的一項(xiàng)研究也表明，MAPK途徑的激活與HPSE的表達(dá)密切相關(guān)[23]。幽門螺桿菌感染胃癌激活MAPK信號(hào)，導(dǎo)致HPSE激活，HPSE的表達(dá)增高，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加[24]。HAO等[25]研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和HPSE的高表達(dá)與TNM分期、浸潤深度和預(yù)后不良呈正相關(guān)。在MKN74細(xì)胞中，外源性HGF顯著增加了HPSE在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明HGF首先激活PI3K/Akt信號(hào)，NF-κB信號(hào)在PI3K/Akt下游被激活，并促進(jìn)HPSE的表達(dá)。然而，當(dāng)使用c-met、PI3K/Akt或NF-κB信號(hào)抑制劑時(shí)，HPSE表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明HGF可通過PI3K/Akt和下游NF-κB信號(hào)調(diào)節(jié)HPSE的表達(dá)，從而促進(jìn)HPSE表達(dá)和隨后的腫瘤轉(zhuǎn)移。CHEN等[20]觀察到上調(diào)的FGF2通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來增加下游Palladin蛋白的表達(dá)，并導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的激活。隨后發(fā)現(xiàn)EMT促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。HPSE/SDC1軸在FGF2的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，HPSE/SDC1軸可作為胰腺癌的有效治療靶點(diǎn)。盧書芳等[26]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中HPSE表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織。HPSE可作為宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。HPSE的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤和預(yù)后有關(guān)。并通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HPSE通過影響p53、c-Myc、h-TERT的表達(dá)，σ1R下調(diào)p53的表達(dá)，Rad21作為Wnt/β-catenin通路的守門人，調(diào)控細(xì)胞周期和XPO1的核輸出功能，Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻滯劑XAV939通過下調(diào)tankyrase、β-catenin及Rad21蛋白的表達(dá)，參與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，增加對(duì)鉑類化療藥物的敏感性。

2.3 乙酰肝素酶與血管生成 HPSE具有兩種活性、酶活性和非酶活性，這兩種功能都會(huì)影響ECM和BM結(jié)構(gòu)完整性。HPSE二聚體的酶活性由50 kDa和8 kDa非共價(jià)連接的亞單位組成，導(dǎo)致ECM重塑，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子、生長因子和脂蛋白的擴(kuò)散，增強(qiáng)血管生成、免疫系統(tǒng)激活、凝血、自噬加速等。HPSE的非酶活性與高凝狀態(tài)有關(guān)，HPSE是組織因子的輔助因子，組織因子通過凝血酶和纖維蛋白升高，最終激活血小板，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血栓形成[27]。研究表明乙酰肝素酶的上調(diào)與腫瘤患者血管密度增加和術(shù)后生存期縮短有關(guān)[28]。HPSE增強(qiáng)Akt信號(hào)，刺激PI3K和p38依賴內(nèi)皮細(xì)胞遷移和入侵。它還通過Src路徑促進(jìn)VEGF表達(dá)。因此，這種酶可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，并引起血管生成和生存反應(yīng)。對(duì)HPSE過度表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，這種酶在正常過程中具有細(xì)胞動(dòng)員、HS周轉(zhuǎn)、組織血管化和改造等功能[29]。HPSE密切參與血管生成，既直接通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的侵入(血管萌芽)，也間接通過釋放HS結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，產(chǎn)生促進(jìn)bFGF活性的HS降解片段。通過基質(zhì)膠塞試驗(yàn)已證明體內(nèi)乙酰肝素酶的血管生成潛力，Eb T淋巴瘤細(xì)胞在用HPSE基因轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)的新血管形成增加了3～4倍。HPSE促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移的能力使其成為癌癥治療的有希望的靶點(diǎn)[8]。

3 HPSE與ACC

ACC是頜面部涎腺常見的惡性腫瘤，因其侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)，該腫瘤治療及預(yù)后不佳。BEN-IZHAK等[30]報(bào)道了HPA基因及其表達(dá)產(chǎn)物與涎腺惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示：70%的涎腺惡性腫瘤患者HPA基因表達(dá)為陽性，HPA基因的表達(dá)水平與涎腺惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，HPA基因表達(dá)為陽性的患者其生存率顯著低于HPA基因表達(dá)為陰性的患者。吳祥冰等[31]發(fā)現(xiàn)HPA在涎腺惡性腫瘤中的陽性表達(dá)率為61.4%，顯著高于其在涎腺良性腫瘤中的陽性表達(dá)率(21.4%)，彼此之間有顯著差異。說明HPA在涎腺腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的病理類型無關(guān)，而與腫瘤的良惡性質(zhì)相關(guān)。王新等[32]采用免疫組織化學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)中HPSE的表達(dá)高于正常涎腺組織，且HPSE在SACC組織中的表達(dá)與患者年齡、原發(fā)腫瘤大小及腫瘤原發(fā)部位無關(guān)，與腫瘤組織分型、神經(jīng)侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示HPSE蛋白的高表達(dá)可能促進(jìn)SACC的神經(jīng)侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)王新團(tuán)隊(duì)[33]利用RNA干擾技術(shù)沉默人SACC-M細(xì)胞中的HPSE的mRNA和蛋白表達(dá)，可抑制SACC-M細(xì)胞的侵襲和遷移能力。因此推測(cè)HPSE在SACC的惡性進(jìn)展中可能起著相當(dāng)重要的作用，可能會(huì)成為預(yù)防和治療ACC侵襲、轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。駱樹瑜[34]采用免疫組化方法檢測(cè)42例ACC組織及癌旁組織和5例正常涎腺發(fā)現(xiàn)，HPSE在臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期ACC患者中的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期ACC的患者；同時(shí)在神經(jīng)侵襲組的表達(dá)高于非神經(jīng)侵襲組，提示HPA可促進(jìn)SACC的侵襲轉(zhuǎn)移，設(shè)法干預(yù)HPA的表達(dá)，可能阻斷SACC的嗜神經(jīng)侵襲。王尚凱等[35]發(fā)現(xiàn)HPA與S-100在腺樣囊性癌蛋白上的表達(dá)是一致的，與腫瘤嗜神經(jīng)侵襲性、局部侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者的年齡、性別和臨床分期無關(guān)。這與王新團(tuán)隊(duì)[33]研究的結(jié)果是一致的。HPSE與SACC的生長和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，用于SACC的聯(lián)合診斷、病情評(píng)估、療效觀察和預(yù)后預(yù)測(cè)。HPSE抑制劑及乙酰肝素酶反義寡核苷酸的研究將為SACC的診治提供理論依據(jù)。

4 HPSE抑制劑研究進(jìn)展

大量實(shí)驗(yàn)及研究證實(shí)了HPSE在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成發(fā)揮重要作用，學(xué)者們紛紛把眼光投入對(duì)HPSE抑制劑的研究中。HPSE抑制劑包括：肝素類似物、硫酸寡聚糖及寡聚糖類似物、中和抗體、天然藥物等。其中寡聚糖類似物、硫酸乙酰肝素模擬物PI-88成為研究熱點(diǎn)。硫酸乙酰肝素模擬物PI-88是硫酸化寡糖的復(fù)雜混合物，在20世紀(jì)90年代后期被鑒定為HPSE的有效抑制劑。在臨床前動(dòng)物模型中，它被證明可以阻斷血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長，并隨后成為第一個(gè)進(jìn)入癌癥臨床試驗(yàn)的HPSE抑制劑[36]。PI-88是一種單磷酸化、多硫酸化甘露糖低聚糖的復(fù)雜混合物，由來自Pichia holstii NRRL Y-2448磷酸甘露糖的低聚糖磷酸部分(OPF)磺化制備而成。它本質(zhì)上是一種底物模擬物，通過靜電相互作用與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，并阻斷HS底物的訪問[37]。PI-88還阻斷血管生成生長因子(如FGF-1、FGF-2和VEGF)與HS及其受體的相互作用，并刺激內(nèi)源性抗血管生成蛋白、組織因子途徑抑制劑的釋放[38]。HOSSAIN等[39]通過研究發(fā)現(xiàn)，PI-88有效的阻斷了HS的兩個(gè)硫酸化位點(diǎn)的活性。PI-88是第一個(gè)在癌癥患者的人類臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估的乙酰肝素酶抑制劑，最終進(jìn)展到肝癌切除后的Ⅲ期試驗(yàn)。盡管有早期的承諾，但它未能達(dá)到其主要終點(diǎn)，并且尚未批準(zhǔn)使用。然而，其早期臨床和臨床前的成功激發(fā)了對(duì)下一代HS模擬乙酰肝素酶抑制劑的研究，該抑制劑具有更好的性質(zhì)和更大的效力。這些努力導(dǎo)致了PG545(匹克西莫德)的發(fā)現(xiàn)和選擇，用于臨床開發(fā)[40]。PG545不僅是一種有效的乙酰肝素酶抑制劑，而且最近被證明具有免疫調(diào)節(jié)活性，這可能是其作用機(jī)制的關(guān)鍵組成部分。PG545最近完成了晚期實(shí)體瘤患者的Ⅰa期研究[41]。HS模擬乙酰肝素酶抑制劑在乙酰肝素酶介導(dǎo)的一系列其他適應(yīng)證中顯示出前景，有待進(jìn)一步的開發(fā)及研究。

5 結(jié)語

目前已知HPSE除參與癌癥外，還參與一系列病理學(xué)，包括炎癥、糖尿病、骨壞死、肝纖維化、淀粉樣變和阿爾茲海默癥，以及多種病毒的感染和傳播[11，42-44]。HPSE在SACC的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成方面均有較大的臨床指導(dǎo)意義。而目前對(duì)于HPSE在SACC的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成分子機(jī)制的研究十分有限，仍有很多問題需要進(jìn)一步探索研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及HPSE研究的逐步深入，HPSE有可能成為評(píng)估SACC預(yù)后或治療反應(yīng)的分子標(biāo)志物，為SACC特定靶向診斷和治療開辟新的途徑，并為SACC的早期診斷及治療提供新的思考方案。未來也仍需進(jìn)一步開發(fā)乙酰肝素酶抑制劑并進(jìn)行臨床試驗(yàn)的研究，以明確乙酰肝素酶抑制劑的作用，從而更好地服務(wù)于臨床。