李紅梅，嚴(yán)麗君，劉 佳，楊 穎，李春華，金 鑫，王永超

(云南師范大學(xué) 職業(yè)技術(shù)教育學(xué)院，云南 昆明 650092)

蠶絲作為“纖維皇后”，其蛋白質(zhì)含量豐富，可高達(dá)98%，是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)之一，蠶絲蛋白主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成[1]。絲素蛋白是沒(méi)有生理活性的天然生物大分子之一，約占蠶絲質(zhì)量的70%～80%，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主，分子構(gòu)象穩(wěn)定，與其它天然高分子相比，優(yōu)點(diǎn)突出。研究表明絲素蛋白具有生物相容性好、無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)刺激性等特點(diǎn)[2]，由此研制出的人造皮膚、人造血管、人造肌腱和人造骨骼等可被用作不同組織修復(fù)的支架材料[3-4]。絲膠蛋白以鱗片狀裹附在絲素外層，形成半透明膠體保護(hù)膜，約占蠶絲質(zhì)量的25%，是一種球狀蛋白，以無(wú)規(guī)則卷曲為主，分子構(gòu)象比較松散和無(wú)序[5]，用來(lái)保護(hù)和膠粘絲素。絲膠擁有多種優(yōu)良特性，如親水性、粘性、抗菌性、抗氧化性等[6-7]。蠶絲的非服飾功能多采用絲素，且制取絲蛋白多以廢繭絲為原料，不含生物活性成分，而對(duì)人體有危害的重金屬和其他它有機(jī)物常附著在絲膠上，脫膠處理后的絲素蛋白對(duì)人體幾乎沒(méi)有影響[8]，因此，利用廢繭絲來(lái)生產(chǎn)絲素蛋白不僅節(jié)約資源，且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在蠶絲蛋白的制取工藝中，最重要的是脫膠和水解兩個(gè)步驟。常見(jiàn)的脫膠方法有堿法、鹽法、酸法、酶法和高溫煮沸法等。幾種方法各有利弊，其中酶法脫膠效率較低;鹽法脫膠很難除去可溶性鹽，對(duì)設(shè)備要求較高，產(chǎn)品的光澤度會(huì)受到影響;酸堿法脫膠若處理不當(dāng)常會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染[9]。相入麗等采用高溫煮沸脫膠法，此法不添加任何化學(xué)試劑，對(duì)設(shè)備要求不高，工藝流程簡(jiǎn)單，便于普遍推廣[10]。

絲素肽是絲素蛋白的水解中間產(chǎn)物，其相對(duì)分子質(zhì)量分布在300～20000 μ 范圍內(nèi)，控制水解程度可以得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的絲肽。李圣春等[11]研究表明絲素肽易被頭發(fā)吸收從而增加頭發(fā)的光澤度和彈性;絲素肽也是天然的保濕劑，可給肌膚提供營(yíng)養(yǎng)，防止皮膚干燥龜裂;絲素肽能夠抑制黑色素生成，美白嫩膚;絲素肽還可提供人體必需氨基酸，有效控制血糖、膽固醇，在預(yù)防自身免疫疾病上發(fā)揮重要作用;絲素肽還能用于隱形眼鏡、人工角膜、人造皮膚和人造血管等生物材料的制造。口服毒性試驗(yàn)結(jié)果表明絲素肽作為化妝品原料是安全可靠的，可按任意比例與某些化妝品原料摻合，且可以不用加入乳化劑、分散劑等[12]。鑒于絲素肽的優(yōu)良特性，其在護(hù)膚品、醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

由于絲素蛋白不溶于水，且很難被酶直接水解，目前常采用堿法和酸法水解絲素蛋白。譚曉慧[13]研究的堿法水解絲素蛋白的最佳水解條件為：加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6% NaOH，料液比為 1 g∶100 mL，60 ℃ 水解 3 h。此法采用較低濃度的堿來(lái)水解，降低堿對(duì)氨基酸的破壞以及減少可溶性鹽，反應(yīng)時(shí)間較短，較為經(jīng)濟(jì);但堿水解法制取的絲素肽相對(duì)分子質(zhì)量較小，用到透析袋純化時(shí)應(yīng)注意透析袋的大小，以提高絲素肽的產(chǎn)量。酸法水解中的酸主要有鹽酸、硫酸和磷酸，研究表明：鹽酸法反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備腐蝕性較強(qiáng)，且鹽酸具有強(qiáng)揮發(fā)性，對(duì)空氣造成嚴(yán)重污染，而且脫鹽較難，所以酸法水解主要使用硫酸和磷酸做溶劑。硫酸水解法具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品質(zhì)量好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但其耗時(shí)較長(zhǎng)，能耗較大;袁慧勇等研究得到的硫酸水解的最佳工藝為：加入98% 硫酸，料液比為1∶3，95 ℃ 水解 6 h[14]。李學(xué)軍等探索出磷酸水解法水解絲素蛋白的最佳條件為：加入85% 磷酸，料液比為1∶4，95 ℃ 水解 6 h，得到復(fù)合氨基酸，該法在制取氨基酸和絲素肽時(shí)具有反應(yīng)條件溫和，時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是水解溫度較高，得到的多數(shù)是氨基酸[15]。

鑒于不同的蠶絲蛋白水解方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，有關(guān)各水解方法對(duì)水解絲素肽的含量影響仍缺乏系統(tǒng)的比較，這對(duì)絲素肽的規(guī)?；a(chǎn)造成了一定的影響。因此，本文對(duì)不同水解方法對(duì)絲素肽含量的影響系統(tǒng)地進(jìn)行比較研究，可為絲素肽的生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)材料為市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮桑蠶繭。

實(shí)驗(yàn)試劑：NaOH、HCl、H2SO4、H3PO4、無(wú)水乙醇和蒸餾水等均為分析純。其它主要試劑有15% 單寧酸、3% 茚三酮乙醇溶液、100 μg/mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、pH為5.4～5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.2% 抗壞血酸溶液、活性炭、氧化鈣、混合催化劑(0.2～0.3 g 硫酸鉀和0.2～0.3 g 五水硫酸銅混合均勻)、硼酸、混合指示劑(0.1% 甲基紅乙醇溶液和0.5% 溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合)。

電子天平：上海卓精;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;安亭TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī); UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津;HR-500半自動(dòng)凱氏定氮儀，上海華睿儀器有限公司。

1.2 蠶繭脫膠方法

本實(shí)驗(yàn)采用高溫煮沸脫膠法進(jìn)行脫膠。

家蠶→剪開(kāi)除雜質(zhì)→加入蒸餾水煮沸 4 h(多次翻拌，及時(shí)補(bǔ)加蒸餾水)→得到絲膠液及不溶物絲素，絲素用蒸餾水洗滌3～4次，低溫烘干備用。

1.3 蠶繭絲素蛋白水解液的制備

1.3.1 H2SO4水解法

稱取 3 g 經(jīng)熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質(zhì)量比為1∶3的比例與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%硫酸混合于燒杯中，在油浴鍋中以 95 ℃ 反應(yīng) 6 h，中途不時(shí)用玻璃棒攪拌。反應(yīng)結(jié)束后取出燒杯進(jìn)行冷卻，用石灰乳中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為硫酸水解法獲得的水解液。

1.3.2 H3PO4水解法

稱取 3 g 經(jīng)熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質(zhì)量比為1∶4的比例與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%磷酸混合于燒杯中，在油浴鍋中以 95 ℃ 反應(yīng) 6 h，中途不時(shí)用玻璃棒攪拌。反應(yīng)結(jié)束后取出燒杯進(jìn)行冷卻，用石灰乳中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為磷酸水解法獲得的水解液。

1.3.3 NaOH水解法

稱取 3 g 經(jīng)熱水脫膠洗凈并干燥好的絲素，以質(zhì)量比為1∶100的比例與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%NaOH混合于燒杯中，在油浴鍋中以 60 ℃ 反應(yīng) 3 h，中途不時(shí)用玻璃棒攪拌。反應(yīng)結(jié)束后取出燒杯進(jìn)行冷卻，用鹽酸中和至pH值為中性或微酸性，再用活性炭吸附脫色、脫臭，得到的濾液即為氫氧化鈉水解法獲得的水解液。

1.4 多肽含量的測(cè)定

1.4.1 上清液中多肽含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定常采用凱氏定氮法，通過(guò)測(cè)出樣品的總含氮量，再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)求得蛋白質(zhì)含量。用單寧酸做蛋白沉淀劑，通過(guò)離心作用把樣品中大分子蛋白質(zhì)與小分子多肽分離，大分子蛋白質(zhì)被沉淀在下層溶液中，小分子物質(zhì)留在上清液中。上清液采用茚三酮顯色法，在氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相應(yīng)的游離氨基酸含量。隨后用上清液中總蛋白質(zhì)含量扣除上清液中游離氨基酸含量，即可獲得上清液中多肽含量。

ρ=N×6.25，

T=ρ-A。

式中：N—樣品的含氮量，%;c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L;V1—空白滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL;V2—樣品消耗滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL;0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol;m—樣品的質(zhì)量，g;6.25為蛋白質(zhì)系數(shù);ρ為總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/100 mL;T為多肽質(zhì)量濃度，g/100 mL;A為游離氨基酸的質(zhì)量濃度，g/100 mL。同一樣品測(cè)定3次，其結(jié)果的算術(shù)平均值作為最終結(jié)果，最終結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后4位。

1.4.2 上清液中總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

離心：分別抽取三種水解液和蒸餾水各 3.0 mL 于4支 25 mL 離心管中，用 4000 r/min 離心機(jī)離心 10 min。隨后吸取 1.0 mL 上清液于 25 mL 比色皿中，加入 3 mL 15%的單寧酸溶液，室溫靜置沉淀 10 min，再次用 4000 r/min 離心機(jī)離心 30 min，上清液為后續(xù)所需的不同水解方法獲得的離心溶液。

消化：準(zhǔn)確抽取上述上清液 2.0 mL 于干燥潔凈的消化管中，并依次加入混合催化劑 0.5 g、10 mL 98% H2SO4，輕輕搖勻，放到消化爐上。打開(kāi)消化爐使溫度升至 421 ℃，開(kāi)始計(jì)時(shí)消化 4 h。關(guān)閉消化爐，冷卻至室溫。

蒸餾、吸收與滴定：先用一個(gè)空管做空白測(cè)試，連續(xù)空蒸3個(gè)左右，預(yù)熱蒸空管。將消解好的樣品空白放入凱氏定氮儀中，關(guān)上安全門，等待儀器蒸餾結(jié)束，先取出消化管再拿出收集氨氣的錐形瓶，之后用 0.01 mol/L 的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，當(dāng)錐形瓶里的液體溶液由藍(lán)綠色變?yōu)槲⒓t色時(shí)即為滴定終點(diǎn)，記錄空白滴定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積V1。按照同樣的步驟，依次將消解好的樣品放入凱氏定氮儀中進(jìn)行蒸餾與吸收，并記錄鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積V2。

1.4.3 上清液中游離氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

茚三酮法測(cè)定游離氨基酸質(zhì)量濃度的原理：游離氨基酸和茚三酮的反應(yīng)分兩步進(jìn)行，第一步是氨基酸被氧化，產(chǎn)生CO2、氨和醛，而水和茚三酮?jiǎng)t被還原成還原性茚三酮;第二步是生成的還原性茚三酮與另一個(gè)水合茚三酮和氨縮合成藍(lán)紫色化合物，該化合物顏色的深淺與氨基酸的質(zhì)量濃度成正比，因此可通過(guò)用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定 570 nm 下的吸光度值即可測(cè)出游離氨基酸的質(zhì)量濃度。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支 25 mL 比色管，分別按照表1所示配制溶液。

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)處理

將上述6支比色管加塞密封置于沸水中加熱 20 min，取出后立即用冷水冷卻并搖動(dòng)，使加熱時(shí)形成的紅色被空氣氧化褪色呈現(xiàn)藍(lán)紫色。將6份氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于 3 cm 比色皿中，另用空白試劑做對(duì)照組，在 570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)樣顯色溶液吸光度。以丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 氨基酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

由以上氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為y=0.023x+0.0599，相關(guān)系數(shù)R2=0.9955，因此在氨基酸質(zhì)量濃度為 0～25 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

上清液中游離氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定：準(zhǔn)確抽取1.4.2中3種水解方法獲得的離心液各 1.0 mL 于3支 25 mL 比色管中，各管中均加入 2.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL 抗壞血酸溶液和 5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，并加水定容至 25 mL，搖勻，蓋塞。置于沸水浴中加熱 20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻。按照氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法在 570 nm 波長(zhǎng)下比色，并在氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的游離氨基酸質(zhì)量濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，用SPSS 26.0軟件分析差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解方法制取的蠶絲蛋白水解液多肽質(zhì)量濃度

不同水解方法制取的蠶絲蛋白水解液中多肽的質(zhì)量濃度如圖2所示。

圖2 不同水解方法對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響

2.2 分析討論

從SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，3種水解方法的P值均小于0.05，差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3種水解方法獲得的水解蠶絲液的多肽質(zhì)量濃度各不相同，其中，H2SO4水解法獲得的多肽質(zhì)量濃度均值為 0.5976 μg/100 mL，H3PO4水解法得到的多肽質(zhì)量濃度均值為 0.1866 μg/100 mL，NaOH水解法獲得的多肽質(zhì)量濃度均值為 0.3786 μg/100 mL。本試驗(yàn)探索出采用98% H2SO4，以1∶3質(zhì)量比于 95 ℃ 下反應(yīng) 6 h 的水解條件是最佳的，獲得的多肽質(zhì)量濃度最高，其次是6% NaOH，以1∶100質(zhì)量比于 60 ℃ 反應(yīng) 3 h，最后是85% H3PO4，以1∶4質(zhì)量比于 95 ℃ 下反應(yīng) 6 h 的條件，該法獲得的多肽質(zhì)量濃度較低。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探索出采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)98% H2SO4，以1∶3質(zhì)量比于 95 ℃ 下反應(yīng) 6 h 的水解條件是最佳的，獲得的蠶絲蛋白水解液多肽質(zhì)量濃度最高。對(duì)不同的水解方法獲得的蠶絲蛋白水解液多肽含量進(jìn)行研究，可為蠶絲蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。我國(guó)蠶繭資源豐富，容易收集，價(jià)格低廉，資源豐富，占有一定的優(yōu)勢(shì);其有效成分在醫(yī)藥、保健、護(hù)膚及食品工業(yè)有廣泛的應(yīng)用，市場(chǎng)占有率高。最終，我們希望能夠拓寬蠶絲蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，提升蠶絲產(chǎn)品的附加值，讓蠶絲為人們帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。