楊興文，馬小芳，李德紅，顏 麗，袁秀梅，楊曉燕，楊 陽(yáng)，司玉春

1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科，甘肅蘭州 730000

游離脂肪酸(FFA)又稱非酯化脂肪酸，大部分FFA與清蛋白結(jié)合存在于血液中，正常情況下血清FFA含量很少。血清中FFA水平與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)。在某些病理狀態(tài)(如糖尿病、代謝綜合征和脂代謝紊亂)下，血清FFA水平升高。過(guò)高的FFA水平引起的高FFA血癥與代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、心力衰竭等疾病的發(fā)生和發(fā)展顯著相關(guān)[1]。FFA是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的物質(zhì)之一[2]，其水平升高引起的氧化應(yīng)激是心血管疾病尤其是糖尿病大血管病變的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增生，促進(jìn)血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。本研究通過(guò)培養(yǎng)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)，了解不同濃度FFA和不同作用時(shí)間對(duì)HA-VSMC增殖活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 正常HA-VSMC購(gòu)買自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)買自杭州四季青生物公司；DMEM培養(yǎng)基、棕櫚酸和MTT試劑購(gòu)買自美國(guó)Sigma公司；0.25%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)買自北京索萊寶生物公司；無(wú)游離脂肪酸胎牛血清清蛋白購(gòu)買自上海生工生物公司；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)熒光染色試劑盒購(gòu)買自廣州銳博生物公司；DMSO購(gòu)買自碧云天生物公司。Thermo?RMK3型酶標(biāo)儀購(gòu)買自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司;RIX71-A12FL/PH型熒光倒置顯微鏡購(gòu)買自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1HA-VSMC的體外培養(yǎng) 將HA-VSMC接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、50%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況每1～2天更換培養(yǎng)液1次，當(dāng)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 (1)0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HA-VSMC；(2)PBS吹打，收集于15 mL離心管中以1 000 r/min離心5 min；(3)棄去PBS后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液后細(xì)胞計(jì)數(shù)；(4)以1.4×105個(gè)/毫升密度接種于96孔板，空白組只加培養(yǎng)液和DMSO，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加培養(yǎng)液、MTT、DMSO，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，在實(shí)驗(yàn)組中加含不同濃度FFA(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)液孵育24、48 h；(5)每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT溶液后繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min；(6)用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)。以上步驟1～4均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2.3EdU熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 (1)96孔板接種和處理細(xì)胞同1.2.2所述；(2)每孔加入100 μL 50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基；(3)PBS清洗2次，每次5 min；(3)每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液；(4)每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸液；(5)每孔加入100 μL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)滲透10 min；PBS洗1次，5 min；(6)每孔加入100 μL 1×Apollo?488熒光染料避光、室溫、孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；(7)每孔加入100 μL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)脫色搖床清洗3次，每次10 min，棄滲透劑；(8)每孔加入100 μL甲醇清洗2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min；(9)每孔加入100 μL Hoechst33342反應(yīng)液避光、室溫孵育30 min，棄染色反應(yīng)液；(10)每孔加入100 μL后PBS清洗1～3次后用熒光顯微鏡(藍(lán)光激發(fā))觀察并拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度FFA對(duì)HA-VSMC形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度FFA對(duì)HA-VSMC形態(tài)學(xué)的影響見(jiàn)圖1，100、200和400 μmol/L組較對(duì)照組HA-VSMC濃密，緊貼細(xì)胞瓶底，細(xì)胞間連接緊密且有劑量依賴性；500、600 μmol/L組較對(duì)照組HA-VSMC稀疏，開(kāi)始出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

注：A～F分別表示對(duì)照組及100、200、400、500、600 μmol/L組HA-VSMC培養(yǎng)48 h形態(tài)。

2.2不同濃度FFA處理后HA-VSMC存活率 采用不同濃度FFA處理HA-VSMC 24和48 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，處理24 h后，100、200、300、400、500、600 μmol/L組存活率均高于對(duì)照組(P<0.01)；處理48 h后，50、100、200、300、400、500、600 μmol/L組存活率均高于對(duì)照組(P<0.01)。兩個(gè)時(shí)間段400 μmol/L組存活率均最高。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度FFA處理后HA-VSMC存活率(%)

2.3EdU熒光染色法檢測(cè)不同濃度FFA對(duì)HA-VSMC增殖活性的影響 EdU熒光染色法結(jié)果顯示，100、200和400 μmol/L組較對(duì)照組HA-VSMC增殖活性明顯增強(qiáng)；500和600 μmol/L組較對(duì)照組HA-VSMC增殖活性明顯減低；各實(shí)驗(yàn)組中400 μmol/L組HA-VSMC增殖活性最強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

注：A、B、C、G、H、I分別為對(duì)照組及100、200、400、500、600 μmol/L組Hoechst染色結(jié)果；D、E、F、J、K、L分別為對(duì)照組及100、200、400、500、600 μmol/L組EdU染色結(jié)果。

3 討 論

心腦血管疾病已成為危害中國(guó)及世界人口健康的“第一殺手”,如何提高心腦血管疾病的診治和預(yù)防水平已成為迫切需要解決的重大醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA與血管病變的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[5]，F(xiàn)FA在誘導(dǎo)血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用，脂代謝紊亂產(chǎn)生大量FFA參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[6-7]，2型糖尿病、糖耐量減低、肥胖、代謝綜合征等患者血清FFA水平顯著升高[8]。FFA水平的升高刺激血管壁細(xì)胞發(fā)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，其中引起的內(nèi)皮細(xì)胞活化和VSMC增殖和遷移是最顯著的[9]。VSMC開(kāi)始增殖并朝著血管內(nèi)腔遷移，從而引起血管壁的增厚及狹窄產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣斑塊，可導(dǎo)致冠心病及中風(fēng)等嚴(yán)重臨床后果[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的FFA處理HA-VSMC，嘗試在體外建立FFA對(duì)血管作用模型，用MTT法和EdU熒光染色法來(lái)觀察HA-VSMC存活率和增殖活性。MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見(jiàn)，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，基于EdU與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行高效快速的細(xì)胞增殖檢測(cè)分析，可以有效地檢測(cè)處于S期的細(xì)胞數(shù)。EdU熒光染色法可直接通過(guò)DNA復(fù)制檢測(cè)細(xì)胞增殖，該方法簡(jiǎn)單、靈敏、快速、準(zhǔn)確，適合各種細(xì)胞系和動(dòng)物體內(nèi)組織器官的細(xì)胞增殖檢測(cè)，目前在細(xì)胞增殖方面的應(yīng)用逐漸增多[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的FFA(≤400 μmol/L)能誘導(dǎo)HA-VSMC增殖，且有時(shí)間和劑量依賴性，隨著濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)；高濃度的FFA(>500 μmol/L)能使HA-VSMC增殖減弱并出現(xiàn)凋亡的形態(tài)改變。

近幾十年中，心臟病學(xué)家在研究動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病機(jī)制及冠心病預(yù)防的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)參與了動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成[10]。研究認(rèn)為，血管病變是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病。炎癥過(guò)程中涉及多種因素以不同的形式參與血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[10]。高嘯波等[12]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA能引起HA-VSMC表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，TLR4/核因子(NF)-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了軟脂酸誘導(dǎo)的HA-VSMC的MCP-1基因表達(dá)。以上研究結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)FA引起的HA-VSMC增殖可能與FFA引起的血管無(wú)菌性炎癥有關(guān)，這為臨床通過(guò)抗炎治療動(dòng)脈硬化等血管疾病提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。