吳 桐 黃 馳 杜兆林 姚懿染 劉治軍

惡性腫瘤在全球的發(fā)病率和死亡率逐年上升，其治療被認(rèn)為是臨床和科研問題中最關(guān)鍵和最重要的課題之一。盡管醫(yī)學(xué)在化學(xué)治療、放射治療和外科手術(shù)方面進(jìn)步斐然，但腫瘤的治療效果并未達(dá)到同等程度的預(yù)期?；虔煼ㄈ諠u成為一種全新的腫瘤治療模式，包括免疫基因治療、反義基因治療、溶瘤病毒治療和自殺基因治療在內(nèi)的多種基因治療方法已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。其中自殺基因療法因其獨(dú)特的作用機(jī)制而備受關(guān)注，其利用基因工程技術(shù)將前藥轉(zhuǎn)換酶基因（自殺基因）轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，編碼產(chǎn)生的酶類將無毒或低毒的前藥轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，隨后通過凋亡或非凋亡機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1］。自殺基因系統(tǒng)主要包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷（HSV-TK/GCV）系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）系統(tǒng)，以及大腸桿菌尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（UPRT）和硝基還原酶（NTR）等。達(dá)到特定的目的需要封裝自殺基因的載體，并將其傳遞給指定的腫瘤細(xì)胞或腫瘤局部環(huán)境。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術(shù)將超聲與各種功能性微泡載體相結(jié)合，可增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，已成為一種極具前景的無創(chuàng)定位基因轉(zhuǎn)移方法，廣泛應(yīng)用于癌癥的基因治療。本文就UTMD 技術(shù)介導(dǎo)下自殺基因的轉(zhuǎn)染在惡性腫瘤治療中的研究進(jìn)展綜述如下。

一、微泡載體系統(tǒng)及UTMD技術(shù)概述

1.微泡載體系統(tǒng)：作為非病毒表達(dá)載體，微泡具備安全性能高、制備成本低、易于快速代謝、可主動(dòng)靶向腫瘤受體等獨(dú)特的優(yōu)勢，成為惡性腫瘤治療方法中更為安全有效的替代方案。微泡在發(fā)展過程中經(jīng)歷了豐富多樣的存在形式，從微氣泡、相變液滴、固體空化核到回聲脂質(zhì)體、納米微粒及從細(xì)菌中提取的蛋白質(zhì)包被的氣體囊泡［2］，不僅性能得到了優(yōu)化，而且粒徑實(shí)現(xiàn)了從微米級到納米級的飛躍。與微米級造影劑相比，納米級造影劑具有更好的生物相容性、穩(wěn)定性及易修飾性，可以提供優(yōu)越的循環(huán)時(shí)間和組織滲透，以獨(dú)特的優(yōu)勢成為新型的基因載體［3］。在微泡外殼加以特異性的配體修飾，形成能夠與腫瘤中的過表達(dá)受體特異性結(jié)合的靶向超聲造影劑，從而限制治療基因負(fù)載載體局部傳遞到腫瘤，提高療效，避免脫靶副作用。Johansen 等［4］合成了一種以受體蛋白酪氨酸磷酸酶mu（PTPmu）衍生的癌癥生物標(biāo)記物為作用位點(diǎn)的靶向納泡，并與非靶向納泡進(jìn)行了對比評估。結(jié)果表明，與非靶向?qū)φ占{泡相比，PTPmu靶向納泡利用超聲分子成像識別腫瘤效果更強(qiáng)、更快，且在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。Wu 等［5］制備了均勻的陽離子納泡，實(shí)驗(yàn)表明其在超聲下顯示明顯的對比度增強(qiáng)，尤其對低頻超聲非常敏感；且?guī)в刑禺愋耘潴w的納泡對裸鼠前列腺特異性膜抗原陽性細(xì)胞和異種移植腫瘤較陰性對照組具有較高的親和力和特異性，說明靶向微泡可使基因?qū)崿F(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)染。

2.UTMD 技術(shù)：將超聲波與各種功能性微泡載體相結(jié)合形成了UTMD 技術(shù)，這是一種新的非病毒基因運(yùn)輸方式。一方面，攜載基因的超聲微泡本身可作為良好的顯像對比劑實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位成像；另一方面，在不同強(qiáng)度超聲波輻照下，微泡被逐一擊破，從而釋放基因到腫瘤部位。此外，在UTMD 作用過程中產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)及空化效應(yīng)使得膜屏障作用減弱［6］，進(jìn)而增加了治療基因向胞內(nèi)運(yùn)輸，使得治療效果大幅提升。UTMD 技術(shù)克服了病毒載體相關(guān)的免疫原性，并具有高時(shí)空分辨率的特點(diǎn)，能夠?qū)崟r(shí)地監(jiān)測和捕獲基因，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮了優(yōu)勢。Li等［7］在一項(xiàng)研究下調(diào)miR-767抑制非小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用UTMD 轉(zhuǎn)染miR-767 抑制劑的細(xì)胞與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-767 抑制劑的細(xì)胞相比，其增殖、侵襲和遷移能力被進(jìn)一步抑制，說明腫瘤的進(jìn)展受UTMD介導(dǎo)的影響。

二、UTMD技術(shù)介導(dǎo)自殺基因在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因形成了一種更有針對性、更為安全有效的自殺基因傳遞系統(tǒng)，以腫瘤特異性受體或組織特異性啟動(dòng)子為作用位點(diǎn)，可在一定程度上避免由于缺乏腫瘤特異性而導(dǎo)致的治療失敗，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的基因治療。

1.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)：目前在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袘?yīng)用的各種自殺基因，以HSV-TK/GCV 系統(tǒng)研究最為透徹。HSV-TK 可催化無毒性抗病毒藥物更昔洛韋（GCV）磷酸化反應(yīng)，通過阻止DNA合成而發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的毒性殺傷作用。此外，旁觀者效應(yīng)將GCV 轉(zhuǎn)導(dǎo)到鄰近細(xì)胞，從而引起周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的死亡。UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域包括肝癌［8-11］、胃癌［12-13］、卵巢癌［14］、腦膠質(zhì)瘤［15-16］、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［17］等；證明UTMD 技術(shù)不僅能夠提高TK 基因的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)腫瘤細(xì)胞和異種移植物的殺傷效果也進(jìn)一步增強(qiáng)，為未來的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。Wu 等［8］研究表明，UTMD技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK 自殺基因系統(tǒng)不僅提高了基因靶向性，而且增強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)染效率，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出顯著的抗癌活性。修陽陽等［18］研究表明，UTMD 技術(shù)介導(dǎo) HSV-TK/GCV 系統(tǒng)還可作為高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）治療后的一種新的輔助療法。HIFU 依據(jù)超聲波能夠穿透軟組織的原理，將高能量超聲聚焦于病變組織，憑借產(chǎn)生的瞬時(shí)機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)殺滅腫瘤細(xì)胞，但在肝癌治療中存在因消融不完全而導(dǎo)致癌組織殘留等問題。謝輝等［19］通過建立異種移植肝癌裸鼠模型，結(jié)果表明載HSV-TK 的液態(tài)氟碳納米粒聯(lián)合UTMD 技術(shù)可降低HIFU 治療后殘瘤組織中的血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α 及微血管密度水平，破壞腫瘤生長的血供條件，進(jìn)而抑制腫瘤生長，提高HIFU 的治療效果。因此，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK/GCV 系統(tǒng)聯(lián)合HIFU對癌癥的治療有協(xié)同作用。

2.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)CD/5-FC 系統(tǒng)：CD 基因可將無毒的前藥5-FC 轉(zhuǎn)化為有毒的代謝物5-氟尿嘧啶（5-FU）。由于體積小和中性電荷，5-FU 可以很容易地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞中［20］。因此，與HSV-TK/GCV 系統(tǒng)相比，CD/5-FC 系統(tǒng)具有遠(yuǎn)程旁觀者效應(yīng)的獨(dú)特優(yōu)勢，從而達(dá)到更大范圍的殺傷效果。研究［21］表明，在UTMD 技術(shù)作用下，攜載CD 基因的陽離子納泡能夠?qū)⒆詺⒒虺晒D(zhuǎn)染并有效表達(dá)，提高殺滅膀胱癌T-24 細(xì)胞的效率，且恢復(fù)縫隙連接蛋白Cx26 表達(dá)，可改善細(xì)胞縫隙連接通訊并加強(qiáng)CD/5-FC 的旁觀者效應(yīng)，在增強(qiáng)殺傷效應(yīng)的同時(shí)又能夠預(yù)防和降低復(fù)發(fā)可能。

3.UTMD 技術(shù)介導(dǎo)雙自殺基因系統(tǒng)：隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2 個(gè)自殺基因聯(lián)合后，各自不同的作用機(jī)制可以互相補(bǔ)充，進(jìn)而大大提高腫瘤的殺傷效率［22］。由于載體轉(zhuǎn)載容量的限制，目前大多數(shù)為雙自殺基因系統(tǒng)，其中以CD/TK 雙自殺基因系統(tǒng)最為常用。UTMD 介導(dǎo)CD/TK 雙自殺基因系統(tǒng)在惡性腫瘤中的研究包括肝癌［22-23］、膀胱癌［24-26］、肺癌［27］、宮頸癌［28］等。Hu 等［26］發(fā)現(xiàn)，CD/TK 雙自殺基因負(fù)載納泡結(jié)合 UTMD 能夠抑制體外膀胱腫瘤細(xì)胞和裸鼠體內(nèi)膀胱癌的增殖，而雙前藥較單前藥具有更顯著的作用。同時(shí)這項(xiàng)研究在肺癌模型中也得到了相同的結(jié)論［27］。除了上述的雙自殺基因，有學(xué)者對UTMD 技術(shù)介導(dǎo)CD/UPRT 和TK/NTR 雙自殺基因?qū)θ橄侔┑闹委熞策M(jìn)行了相應(yīng)的研究。Paris 等［29］開發(fā)了一種新型的介孔二氧化硅納米粒用于制備超聲納泡，進(jìn)而負(fù)載CD/UPRT 融合自殺基因，聯(lián)合UTMD 技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSCs）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了自殺基因的DMSCs，當(dāng)暴露于無毒的前藥物5-FC時(shí)，會產(chǎn)生一種有毒藥物，這種有毒物質(zhì)從DMSCs源擴(kuò)散，到達(dá)周圍的癌細(xì)胞，從而能夠誘導(dǎo)共培養(yǎng)的大鼠乳腺癌細(xì)胞死亡。Devulapally 等［30］合成了聚乙二醇（PEG）?；廴樗?乙醇酸/聚乙烯亞胺納米粒（PLGA/PEI NP），并與TK/NTR 融合基因結(jié)合。結(jié)果表明，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)TK-NTR-DNA-NP 復(fù)合物轉(zhuǎn)染后，在體外三陰性乳腺癌細(xì)胞中用GCV/CB1954前藥處理顯示出有效的細(xì)胞殺傷作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UTMD 技術(shù)可以成功地將TK/NTR 基因轉(zhuǎn)移到小鼠腫瘤中，并顯示出TK/NTR 蛋白的高表達(dá)水平，且其腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05）。表明UTMD技術(shù)介導(dǎo)TK/NTR 基因可作為三陰性乳腺癌患者的潛在臨床治療選擇。除了自殺基因之間的相互聯(lián)合，自殺基因還可與其他介導(dǎo)腫瘤凋亡的基因形成融合基因，在UTMD 技術(shù)作用下，對腫瘤的抑制起到協(xié)同作用。Kumar 等［31］合成了一種三重治療基因TK-p53-NTR，結(jié)果表明TK、NTR 自殺基因與P53 抑癌基因?qū)θ幮匀橄侔?、肝癌?xì)胞及裸鼠模型均有協(xié)同抗癌效果，且聯(lián)合miRNAs 使得前藥GCV 和CB1954 對腫瘤細(xì)胞有效致敏，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。此外，UTMD 技術(shù)顯著增加了體內(nèi)負(fù)載miRNAs 和TK-p53-NTR 納泡的腫瘤內(nèi)傳遞，從而增加了治療效果，可以實(shí)現(xiàn)較傳統(tǒng)治療方法更有效的抗癌治療。

4.多模態(tài)成像介導(dǎo)的自殺基因治療：目前的診斷成像方法，如超聲成像、光聲成像、熒光成像，均有其自身的局限性。隨著多功能造影劑的快速發(fā)展，超聲成像與其他成像方法相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像。因而UTMD 技術(shù)與其他先進(jìn)的治療技術(shù)相結(jié)合，使得自殺基因以更為完善的方式發(fā)揮療效。Wang 等［32］設(shè)計(jì)了一種雙模態(tài)的超聲/近紅外熒光（NIRF）造影劑，并將其應(yīng)用從圖像對比度增強(qiáng)擴(kuò)展到超聲定向和部位特異性靶向的聯(lián)合診斷和治療。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估聚乙烯亞胺和DNA 復(fù)合物偶聯(lián)的近紅外熒光金納泡（PEI-DNA/NIR797/AuMBs）作為雙模態(tài)造影劑的潛力，結(jié)果表明所開發(fā)的治療性AuMB 復(fù)合物不僅可以提供良好的超聲和NIRF 成像以檢測腫瘤，而且可以作為一種有效的超聲觸發(fā)載體，用于異種移植裸鼠腫瘤的基因傳遞和光熱消融。與單基因治療或單次暴露組（超聲或NIRF）比較，超聲+NIRF 暴露組細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡和壞死率，以及Bel-7402 異種移植物抑制率均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。表明超聲聯(lián)合近紅外熒光成像介導(dǎo)的雙融合自殺基因?qū)τ谔峁└娴脑\斷信息，以及指導(dǎo)更準(zhǔn)確、有效的協(xié)同癌癥治療具有重要價(jià)值。

三、總結(jié)與展望

總之，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)染是一種極具臨床應(yīng)用潛力的無創(chuàng)靶向基因轉(zhuǎn)移方法，大量的臨床前研究不僅證明了基因傳遞的可行性，而且還有可量化的治療效果。然而，這項(xiàng)技術(shù)研究多停留在細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在向臨床轉(zhuǎn)化的道路上仍存在挑戰(zhàn)。酶和前藥的開發(fā)、轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化、微泡造影劑的安全性及靶向性等問題仍需進(jìn)一步探索。優(yōu)勢互補(bǔ)的多模態(tài)成像是UTMD 技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療的發(fā)展趨勢，有望實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的診療一體化。相信在國內(nèi)外學(xué)者的共同努力下，UTMD 技術(shù)介導(dǎo)自殺基因治療惡性腫瘤終將從實(shí)驗(yàn)研究過渡到臨床應(yīng)用，以更全面、更實(shí)際的方式服務(wù)于人類健康。