柯婷 祁海燕 李婷 王高雷 杭程 王露露 師韓菲 董丹丹 肖洋

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

目前關(guān)于糖尿病合并脂肪肝的發(fā)病率逐年增加，我國2型糖尿病患者脂肪肝發(fā)病率高達(dá)67.9%[1]，胰島素抵抗是兩者共同作用機(jī)制[2-3]，機(jī)體胰島素分泌異常，胰島素敏感性降低，血漿脂蛋白清除能力下降，大量脂肪酸合成，從而形成脂肪肝[4-6]，脂質(zhì)代謝紊亂則進(jìn)一步影響胰島素分泌，血糖調(diào)節(jié)功能障礙，兩者相互影響，則成為心腦血管疾病、全因死亡風(fēng)險(xiǎn)共同作用因素。

有研究認(rèn)為，胰島β細(xì)胞為維持個(gè)體內(nèi)血糖平穩(wěn)，肝臟組織在胰島素抵抗下，需分泌胰島素代償，從而導(dǎo)致高胰島素血癥，且需提高內(nèi)固醇調(diào)控組件蛋白1-C(sterol regulatory element blinding protein-1c,SREBP-1c)、肝X受體(liver Xreceptors,LXR)的呈現(xiàn)。葡萄糖也可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(ChREBP)的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的生物合成，平衡體內(nèi)脂肪生成基本表達(dá)的SREBP-1c升高脂肪酸合成作用，加速干細(xì)胞內(nèi)脂肪儲存[7-9]。LXR是新發(fā)現(xiàn)的一種肝臟內(nèi)脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子，其可與SREBP-1c形成正反饋調(diào)節(jié)回路，參與調(diào)控肝臟內(nèi)的脂質(zhì)生成過程[10]。脂肪細(xì)胞分泌的脂聯(lián)素可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)促進(jìn)肝臟和肌肉內(nèi)的脂肪酸氧化代謝過程，抑制肝臟糖異生和脂質(zhì)生成作用。因此基于PPARa通路的糖尿病合并脂肪肝作用機(jī)制研究成為本病臨床診治的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于此類疾病沒有特效藥物[11]，且治療用藥副作用較大、作用靶點(diǎn)單一等可導(dǎo)致治療過程中存在諸多不足，從而引起一系列醫(yī)療資源的過度消耗、住院費(fèi)用上漲、人們生活質(zhì)量下降等。中醫(yī)學(xué)關(guān)于糖尿病合并脂肪肝沒有明確記載，分散于“消渴”“脅痛”“積聚”等內(nèi)容，歷代醫(yī)院關(guān)于本病治療確有一定療效[12]。長安米氏內(nèi)科流派路波主任醫(yī)師在臨床實(shí)踐中，認(rèn)為嗜食肥甘厚膩，燥熱、濕濁內(nèi)生，熱熾胃腸、濕熱困脾，久則痰瘀互結(jié)，遂研制運(yùn)脾化濁方，療效顯著。故本研究制備糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，通過運(yùn)脾化濁方與鹽酸二甲雙胍干預(yù)對照研究，闡述運(yùn)脾化濁方對模型大鼠血糖、胰島素及SREBP-1、ChREBP、PPARa和調(diào)節(jié)因子LXR表達(dá)機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 ACS電子秤(杭州萬特衡器有限公司)；Centrifuge5430離心機(jī)(德國艾本德公司)；KD-BM包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；OLYMPUS CK31正置光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；MSX2成像系統(tǒng)(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)；Champchemi 610 plus全自動化學(xué)/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；GTR16-2低溫高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；NMYA-60搖床(泰州諾米醫(yī)療科技有限公司)；DW-86L338J -80 ℃度醫(yī)用冰箱(深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 運(yùn)脾化濁免煎制劑(藥物組成為：黃連、黃芩、郁金、清半夏、干姜、黨參、薤白、丹參、白芍、山楂等)：中藥方由陜西省中醫(yī)醫(yī)院米氏內(nèi)科內(nèi)分泌二科提供，陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥免煎制劑中心配制，1 劑/天，分早、晚 2次開水沖化后溫服；鏈脲佐菌素(北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號：S1030-100 mg)；異丙醇(華北地區(qū)特種試劑開發(fā)中心)；β-巰基乙醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司)；Ribonuclease inhibitor(貨號D2310A,日本TaKaRa公司)；dNTP Mixture(貨號4019,日本TaKaRa公司)；M-MLV Reverse Transeriptase(貨號M1701,美國Promega公司)；PowerUp SYBR Green Master mix(貨號A25741,德國Qiagen公司)。DEPC水(貨號R1600，北京索萊寶科技有限公司)、Oligo(dT)18 Primers(貨號3806，日本TaKaRa公司)；變性緩沖液(TRIZOL)(貨號15596018，美國ThermoFisher Scientific公司)；30%的丙烯酰胺制膠液(29∶1)(貨號Cat#A1010，北京索萊寶科技有限公司)；RIPA裂解液(貨號P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TEMED(貨號L19S10G98319，上海源葉生物科技有限公司)；BSA(貨號4240GR100，德國Biofroxx公司)；TWEEN 20(貨號1247ML500，德國Biofroxx公司)；甘氨酸(貨號Cat#G8200，北京索萊寶科技有限公司)；Tris(貨號1115GR500，德國Biofroxx公司)；Ultra SYBR mixture(low rox)(貨號CW2601H，康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Rabbit Anti-WBSCR14 antibody(貨號bs-3516R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；SREBP-1 Polyclonal Antibody(貨號414584，美國Signalway Antibody公司)；PPAR-αPolyclonal Antibody(貨號413594，美國Signalway Antibody公司)；LXR-A Antibody(貨號25041，美國Signalway Antibody公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠33只(許可證號：NO1103222011002509)，約(100±20)g，購于北京華阜康。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組與給藥 所有實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組：除空白組予以生理鹽水外，余組大鼠均予以高糖高脂(成分：10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽和68%基礎(chǔ)飼料混合)飼料喂養(yǎng)1月后，連續(xù)5 d給予STZ(40mg/kg/d，腹腔內(nèi)注射)，7 d(即STZ 7 d)后，用血糖儀取尾靜脈血測空腹血糖，以連續(xù)3 d大鼠空腹血糖值(FBG)高于11.1 mmol·L-1的大鼠作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。成模后繼續(xù)給予高糖高脂飲食喂養(yǎng)1月，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組，即：運(yùn)脾化濁組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、二甲雙胍組、模型組，正常組每日予以生理鹽水灌胃(1 mL/只)、運(yùn)脾化濁組每日予以免煎中藥灌胃(3 mL/只)、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組灌胃(免煎中藥：2 mL/只、二甲雙胍：1 mL/只)、二甲雙胍組灌胃(3 mL/只)。治療8周結(jié)束后3 d處死大鼠，取全血或血清檢測生化指標(biāo)，取肝臟組織進(jìn)行HE染色觀察。

2.2飼養(yǎng)環(huán)境 飼養(yǎng)于干凈實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度為(21±3)℃，相對濕度為60%～80%，自然光照射。保持安靜環(huán)境，自由飲水進(jìn)食。

3 結(jié)果

3.1一般情況比較 ①正常對照組：體重增加，健康活潑，毛發(fā)鮮亮光滑，食欲正常，無死亡情況；②模型組：明顯消瘦，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)粗糙，多飲多食多尿，死亡1只；③運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組：體重?zé)o明顯變化，然較正常對照組稍偏低，毛發(fā)整潔，精神狀態(tài)尚可，食量尚可，大便顏色略偏深，無死亡情況；④二甲雙胍組：體重減輕，毛發(fā)欠光澤，精神一般，飲食尚可，多尿，大便顏色偏深，死亡1只；⑤運(yùn)脾化濁組：形體略偏瘦，毛發(fā)尚光澤，精神一般，食欲佳，大便顏色正常，無死亡情況。其中大鼠死亡情況考慮為灌胃不當(dāng)所致。

3.2大鼠體重研究 各組大鼠體重比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中二甲雙胍組較正常對照組大鼠體重減輕明顯(P<0.01)，見表1。

表1 大鼠體重比較

3.3各組葡萄糖及胰島素水平變化 各組大鼠血糖比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中正常對照組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組及運(yùn)脾化濁組較模型組血糖水平均明顯偏低(P<0.01)，正常對照組較運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、二甲雙胍組、運(yùn)脾化濁組血糖水平均明顯偏低(P<0.01)，運(yùn)脾化濁組較二甲雙胍組血糖水平有所偏低(P<0.05)。血清胰島素各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血糖及胰島素比較

3.4Western Blot法檢測 將稱取50 mg肝臟組織塊置于1.5 mL的離心管中，加入RIPA裂解液150 μL，用干凈剪刀將組織塊盡量剪碎，用研磨器研磨；研磨完畢再加入750 μL的RIPA裂解液，置于冰上裂解1 h。取出離心管上下混勻，放入低溫高速離心機(jī)中4℃下12000 r·min-1離心20 min，離心后上清液，移至1.5 mL離心管中，并置于-80 ℃保存。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的濃度計(jì)算上樣量，變性、電泳，再進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)膜檢測。

各組大鼠ChREBP表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，SREBP-1蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中正常對照組、二甲雙胍組較模型組SREBP-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組較模型組SREBP-1表達(dá)水平略降低(P<0.05)。LXR表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中正常對照組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組較模型組LXR表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，二甲雙胍組較模型組LXR略降低，正常對照組較二甲雙胍組及運(yùn)脾化濁組相比LXR略降低(P<0.05)。PPARa表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，正常對照組較模型組比較PPARa表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠ChREBP、SREBP-1、LXR與PPARa比較

4 結(jié)論

糖尿病合并脂肪肝目前是影響人類健康的主要代謝性疾病，是導(dǎo)致心血管事件發(fā)生，降低生活質(zhì)量的后備患者人群。長期糖脂代謝紊亂與機(jī)體胰島素抵抗密切相關(guān)。血糖升高，可產(chǎn)生高胰島素血癥，葡萄糖代謝和利用功能障礙，脂肪酸合成增加，可進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積，肝細(xì)胞損害，在氧化應(yīng)激條件下，對肝細(xì)胞則造成“二次打擊”[13-14]，這是糖尿病合并脂肪肝核心發(fā)病基礎(chǔ)，也是影響疾病遷延難愈的關(guān)鍵。

長安米氏內(nèi)科流派在前期大量臨床觀察中，總結(jié)認(rèn)為本病發(fā)病系胃腸燥熱太過，脾不運(yùn)化，脾虛痰盛，痰濁瘀阻，互結(jié)為病，故研制“運(yùn)脾化濁方”[15-17]，可有效改善患者胰島素抵抗及生化指標(biāo)，減少內(nèi)臟脂肪含量，臨床療效顯著。本方以苦寒之黃連、黃芩、郁金三味藥瀉中焦胃熱[18]，黃連分治三焦火邪，黃芩可清內(nèi)郁之熱邪，與黃連同用，清熱功著。研究證實(shí)[19]，黃連有效成分可改善2型糖尿病小鼠的肝糖原結(jié)構(gòu)，同時(shí)可降低血脂水平。黃芩苷能顯著降低免疫性肝損的轉(zhuǎn)氨酶，減輕肝細(xì)胞壞死[20]。郁金行氣解郁、清心涼血，具有保肝降脂、抑菌抗炎功效[21]。半夏、干姜味辛散痰濁之郁結(jié)；黃連與半夏同用可改善糖脂代謝[22]。干姜性熱、味辛，具有抗氧化、抗病原體、保肝利膽、改善局部血液循環(huán)等多種作用[23]。黨參、薏苡仁以健脾燥濕，杜生痰之源，可佐制黃連苦寒?dāng)∥钢?，黨參可降低血糖、抑制醛糖還原酶活性，降低總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇，提高高密度脂蛋白膽固醇含量[24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[25]，薏苡仁多糖具有降糖作用，效果與濃度呈正相關(guān)，且可改善脂質(zhì)代謝異常。配山楂酸甘之品消積祛瘀化痰，可調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，降低血糖，降低胰島素抵抗指數(shù)[26]；丹參、川芎、三七等行氣活血化瘀，其中丹參有效成分是脂溶性的化合物，具有擴(kuò)張血管、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗動脈粥樣硬化，保護(hù)肝細(xì)胞和抗纖維化[27]。川芎辛香溫燥，走而不守，為血中之氣藥，可保護(hù)臟器細(xì)胞、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等[28]。三七具有降血脂、抗氧化、抗焦慮和免疫調(diào)節(jié)等作用[29]。本方合中藥性味辛、苦、酸以達(dá)開郁運(yùn)脾、清瀉郁熱、酸化陰精、化痰活血之功。

本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，經(jīng)研究觀察，模型組大鼠明顯消瘦，多飲多食多尿。鹽酸二甲雙胍組體重減輕，飲食一般，多尿，大便顏色偏深。而運(yùn)脾化濁單組和與鹽酸二甲雙胍連用組較模型組大鼠體重?zé)o明顯變化，大鼠毛發(fā)整潔，食量尚可，無死亡情況。與模型組相比，正常對照組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組及運(yùn)脾化濁組血糖均顯著下降，運(yùn)脾化濁組較鹽酸二甲雙胍組下降明顯。血清胰島素各組無明顯差別。各組ChREBP無明顯差異。運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組及鹽酸二甲雙胍組SREBP-1較模型組有所降低，運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組及鹽酸二甲雙胍組LXR較模型組下降。由此可知，運(yùn)脾化濁顆粒在改善糖尿病合并脂肪肝模型大鼠一般狀況、降糖及降低促進(jìn)胰島素抵抗的蛋白水平方面具有一定優(yōu)勢，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)、基因測序等提供有力的研究基礎(chǔ)。