曹蓓苓 潘賜明 楊曉潔 范瀚中 李奇奇 夏雨欣 陳文慧

(云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500)

近期研究顯示，河南豫東地區(qū)腦卒中發(fā)病率8.3%，上海市長寧區(qū)腦卒中報告標(biāo)化發(fā)病率為166.12/10萬，標(biāo)化死亡率為19.62/10萬，發(fā)病類型和死亡患者均以缺血性腦卒中為主，發(fā)病率高達(dá)84.74%，死亡率高達(dá)61.34%[1-2]。而另一項中國近15年調(diào)研顯示，我國缺血性腦卒中發(fā)病率為145/10萬，患病率為1 256/10萬，死亡率為62/10萬[3]。2019年與2009年相比，傷殘調(diào)整壽命年增加了 5.9%，男性高于女性[4]。傷殘損失健康壽命年為374.5/10萬[5]。近年來，腦卒中已經(jīng)成為健康的一大殺手，其死亡率第二，致殘率第六，在青年卒中亦呈現(xiàn)上升趨勢[6-7]。

角藥的配伍思想來源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，首次使用則首推仲景，其中“干姜、細(xì)辛、五味子”可以說是角藥之濫觴，角藥之配伍具有一定的條件，如有人認(rèn)為角藥必須滿足以下條件中的兩個方可：①存在著相須相畏關(guān)系者；②存在著相反相成關(guān)系者；③存在著協(xié)同相輔關(guān)系者[8-9]。角藥的主要表現(xiàn)形式分為獨立成方之“角藥”和組成方劑內(nèi)容之“角藥”[10]。角藥包含著中醫(yī)哲學(xué)理論、四氣五味理論以及升降浮沉理論，能夠簡潔的體現(xiàn)出方劑“七情”配伍關(guān)系，藥簡而內(nèi)涵豐富[11]。

基于數(shù)據(jù)挖掘 《中醫(yī)方劑大辭典》中治療中風(fēng)的1130 首方劑，結(jié)果顯示川芎-防風(fēng)-麻黃角藥是常用于治療腦卒中的配伍組方，其支持度高達(dá)12.4%[12-13]。防風(fēng)、麻黃同為辛溫，但麻黃發(fā)散力強(qiáng)，防風(fēng)為風(fēng)藥之潤劑，兩者相須相使；川芎為血中之氣藥，行氣活血，三者配伍，既能治外風(fēng)邪氣，又能治血滅內(nèi)風(fēng)，即血行風(fēng)自滅[14]。川芎-防風(fēng)-麻黃亦為孫思邈的自擬續(xù)命湯的核心藥物，即后世醫(yī)家的大小續(xù)命湯，在臨床具有較好的療效。金·劉完素《黃帝素問·宣明論方》[15]的防風(fēng)通圣散中亦含有川芎-防風(fēng)-麻黃的組合，防風(fēng)通圣散治療風(fēng)熱雍盛、三焦熱實證的患者，有效率達(dá)76.7%[16-17]。

有介于此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對高頻次的角藥主要活性成分的作用靶點以及生物通路等進(jìn)行綜合分析，揭示川芎-防風(fēng)-麻黃角藥的主要活性成分及藥理作用機(jī)制。

1 方法

1.1化學(xué)成分篩選 選用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/index.htm)以口服利用度(OB)≥30%或類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，對川芎-防風(fēng)-麻黃角藥主要化學(xué)成分進(jìn)行篩選。同時以ETCM數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/ETCM/)為輔助查詢以及檢索相關(guān)文獻(xiàn)報道，最終合并檢索到的成分，通過 PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集可能性>10%的靶點。

1.2網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 通過檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)基因，后通過UniProt數(shù)據(jù)庫，得到活性成分潛在靶點的基因靶點。利用R語言VennDiagram數(shù)據(jù)包得出川芎-防風(fēng)-麻黃潛在靶點和卒中相關(guān)靶點交集。將交集核心靶點上傳至STRING，選擇置信度≧0.95作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3GO及KEGG富集分析 使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8 在線富集分析平臺對上述獲得的相關(guān)核心靶點進(jìn)行生物功能及分子信號通路的富集分析，將P value值定義小于0.05。繪制GO功能富集分析氣泡圖、KEGG氣泡圖以及通路圖。

2 結(jié)果

2.1活性化合物篩選 對川芎-防風(fēng)-麻黃在TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索化合物，按照OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選出共52個活性化合，其中麻黃26個、防風(fēng)19個、川芎7個，見表1。

表1 活性藥物成分

2.2疾病相關(guān)基因獲取 通過檢索GeneCards(5545個)、OMIM(0個)、Drugbank(28個)、TTD(34個)、PharmGkb(1個)數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)基因，見圖1。

圖1 疾病相關(guān)基因合并圖

2.3川芎-防風(fēng)-麻黃角藥防治卒中靶點韋恩圖 利用R語言VennDiagram數(shù)據(jù)包得出川芎-防風(fēng)-麻黃角藥潛在靶點和卒中相關(guān)靶點交集，共發(fā)現(xiàn)176個共同基因，確定為川芎-防風(fēng)-麻黃角藥治療卒中的靶基因，生成韋恩圖，見圖2。

圖2 核心靶點篩選韋恩圖

2.4川芎-防風(fēng)-麻黃角藥靶點與卒中相互作用網(wǎng)絡(luò) 將候選化學(xué)成分與卒中基因靶點通過Cytoscape 3.7.1建立川芎-防風(fēng)-麻黃角藥成分靶點-卒中靶點群網(wǎng)絡(luò)，中間部分菱形代表中藥潛在活性成分，不同的顏色代表來自不同的藥物，青色來自麻黃，紫色來自防風(fēng)，紅色來自川芎，外邊圓性代表潛在的作用靶點，兩者的相互關(guān)系如圖所示，見圖3。

圖3 活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

2.5蛋白相互作用分析 將交集核心靶點上傳至STRING，選擇置信度≧0.95作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，圖中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點表示靶點蛋白，每條邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，兩個節(jié)點之間，線條越多表示之間的關(guān)聯(lián)度越大，見圖4。使用R軟件查找PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點AKT1、BAD、BCL2L1、CASP、CCND1、CDKN1A、EGF、F3、FOS、IKBKB、JUN、KDR、PLAT、PLAU。

圖4 核心靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6川芎-防風(fēng)-麻黃角藥對治療卒中的GO功能與KEGG富集分析 對3個核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析，選取最具有統(tǒng)計學(xué)意義的前30條，結(jié)果見氣泡圖，圖5。富集結(jié)果顯示：①在BP中主要涉及對營養(yǎng)水平的反應(yīng)(response to nutrient levels)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)等；②在CC中靶點涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain )、膜區(qū)(membrane region)等；③在MF中靶點相關(guān)分子功能主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)。

KEGG富集結(jié)果提示川芎-防風(fēng)-麻黃角藥干預(yù)卒中涉及的關(guān)鍵基因靶點主要有PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人巨細(xì)胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)等。見圖6、圖7。

圖6 KEGG富集氣泡圖

圖7 卒中通路圖

3 討論

近年來，高血壓、高血脂、高血糖和高尿酸已經(jīng)嚴(yán)重影響人民健康[18]。從危險因素來看，糖尿病、代謝綜合征、頸動脈粥樣硬化、高血壓史與高脂血癥史是影響缺血性腦卒中的最主要因素[19-20]。因此，隨著慢性病發(fā)病率不斷上升，腦卒中已經(jīng)首當(dāng)其沖。中醫(yī)早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期就有中風(fēng)的相關(guān)記載，如《素問·風(fēng)論》中記載“入房汗出中風(fēng)”之說，以及“偏枯”的描述，奠定了“內(nèi)虛邪中”的外風(fēng)學(xué)說[21]。總體而言，金元以前多以內(nèi)虛邪中立論，金元時期突出以內(nèi)風(fēng)立論，此外王履、陳士鐸強(qiáng)調(diào)真中、類中[7]。中醫(yī)治療中風(fēng)有完整的理論體系，亦有豐富的臨床經(jīng)驗，中風(fēng)無外乎正虛邪實，即氣血不足，外邪侵襲，統(tǒng)計顯示氣虛、血瘀是缺血性中風(fēng)主要證候要素[8]。中風(fēng)發(fā)病急促，致死致殘率高，急則治其標(biāo)，重在驅(qū)邪活血，《金匱要略》云：“夫病痼疾加以卒病，當(dāng)先治其卒病，后乃治其痼疾也”[22]。川芎-防風(fēng)-麻黃角藥是大、小續(xù)命湯的核心藥物，經(jīng)過臨床檢驗，小續(xù)命湯在中風(fēng)急性期療效可靠[23]。全方體現(xiàn)了唐宋以前治療中風(fēng)病的基本思路[24]。小續(xù)命湯加減治療能有效改善急性腦梗死病人臨床總有效率OR=2.74[25]。中醫(yī)大家李可老中醫(yī)亦治中風(fēng)不離麻黃，體現(xiàn)了驅(qū)邪化瘀的重要性。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析表明，川芎-防風(fēng)-麻黃角藥中主要活性成分豆甾醇、槲皮素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、楊梅酮、川芎哚等。川芎具有上行頭目，活血行氣，祛風(fēng)止痛的功效[26]。《神農(nóng)本草經(jīng)》[27]載：“味辛，溫。主中風(fēng)入腦，頭痛，寒痹，筋攣，緩急，金創(chuàng)?！贝ㄜ旱闹饕煞譃榇ㄜ亨?、川芎哚、楊梅酮，臨床研究顯示川芎嗪能改善腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損評分，無明顯不良反應(yīng)[28]。川芎有擴(kuò)張血管,改善微循環(huán)等作用[29]。川芎哚可以抑制血小板聚集、降低神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、抗中樞神經(jīng)缺血損傷、抗氧化等[30]。楊梅酮具有抗氧化作用[31]。防風(fēng)具有止痛解痙之功效，陶弘景《本草經(jīng)集注》[32]載：“味甘、辛，溫，無毒。主治大風(fēng)，頭眩痛，惡風(fēng)，風(fēng)邪，目盲無所見，風(fēng)行周身，骨節(jié)疼痹，煩滿?！?防風(fēng)主要化學(xué)成分為升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，具有抗凝血、抗血栓、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等藥理作用[33]。麻黃具有疏風(fēng)散寒之功效，葉天士《本草經(jīng)解》[34]載：“氣溫，味苦，無毒。主中風(fēng)傷寒頭痛，溫瘧發(fā)表出汗，去邪熱氣，止咳逆上氣，除寒熱，破癥堅積聚。” 現(xiàn)代藥理研究麻黃主要以抗氧化、抗血栓形成以通調(diào)血脈，興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)以通竅醒神[35]。麻黃非生物堿類成分對實驗性高脂血癥小鼠有降血脂作用，這與高脂血癥史是影響缺血性腦卒中的最主要因素的研究相一致[36]，提示麻黃作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血脂相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

PPI網(wǎng)絡(luò)表明，川芎-防風(fēng)-麻黃角藥中的有效成分可能通過AKT1、BAD、BCL2L1、CASP、CCND1、CDKN1A、EGF、F3、FOS、IKBKB、JUN、KDR、PLAT、PLAU等藥物-疾病共有靶點進(jìn)行作用。其中CASP參與細(xì)胞凋亡，而AKT1在控制細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要作用，對缺血性損傷后的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[37-38]。

GO生物過程分析主要涉及對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等過程。KEGG結(jié)果表明川芎-防風(fēng)-麻黃角藥可能通過PI3K/Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染等。PI3K/Akt信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用[39]。川芎-防風(fēng)-麻黃角藥其作用機(jī)制與激活PI3K/Akt通路相關(guān)。NF-κB信號通路的激活會增加神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致增大梗死面積，從而破壞神經(jīng)功能[40]，通路圖顯示川芎-防風(fēng)-麻黃角藥通過影響PKC進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游的ERK1/2、P38、JNK、AP-1、NF-κB發(fā)揮作用，抑制炎癥，減小梗死面積，保護(hù)神經(jīng)功能。

綜上所述，本研究通過生物信息技術(shù)，對川芎-防風(fēng)-麻黃角藥多成分、多靶標(biāo)、多通路的復(fù)雜作用機(jī)制進(jìn)行研究，初步揭示川芎-防風(fēng)-麻黃角藥防治疾病的分子機(jī)制，本研究結(jié)果可能存在一定的局限性，需要進(jìn)一步驗證。