賀維濤 趙重博 年婧

(1.涇陽(yáng)縣醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 713700；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

珠子參為五加科植物珠子參PanaxjaponicasC.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y.Wu et K.M.Feng或羽葉三七PanaxjaponicusC.A.Mey.var bipinnatifidus (Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖，主產(chǎn)云南、陜西、四川等地，陜產(chǎn)珠子參也是陜西太白七藥里的八大金剛之一——紐子七，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰，祛瘀止痛，止血，抗肺纖維化的功效[1-2]。研究報(bào)道珠子參多糖PJPS1-A對(duì)血虛模型小鼠的造血功能有很好的保護(hù)作用[3]，同時(shí)體外研究表明珠子參多糖對(duì)肝癌[4-5]、胃癌[6]、抗補(bǔ)體活性[7]和衰老[8]也有一定的功效，而抗氧化活性與癌癥和衰老密切相關(guān)，因而研究其提取工藝和抗氧化活性更加重要。

植物根莖類(lèi)組織一般富含較多的纖維素，因此使用纖維素酶提高該類(lèi)中藥多糖的得率是常用的方式[9]。之前已有應(yīng)用正交設(shè)計(jì)研究超聲提取和水提醇沉法制備珠子參多糖的工藝研究，因此選用水作為提取溶劑[10-11]，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化珠子參多糖提取工藝并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為珠子參的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Autoscience AS 5150A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；電熱式恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器 (成都超純科技有限公司)；DB-206SC電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(成都天宇試驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司)；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī)(寧波新藝生物科技股份有限公司)；FA2004N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；METTLER TOLEDO十萬(wàn)分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 珠子參藥材，購(gòu)于陜西眉縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王昌利教授鑒定為珠子參PanaxjaponicusC.A.Mey.v ar.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(純度≥99.5%，批號(hào)：140974-110833，中國(guó)食品藥品檢定研究所)；濃硫酸、苯酚、乙醇等均為分析純；纖維素酶(10 000 U·g-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；Vc標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(純度≥99%，批號(hào)：S05J6G1，上海源葉生物科技有限公司)；DPPH標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(Diybio生物科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1珠子參多糖的含量測(cè)定

2.1.1供試品溶液的制備 稱取珠子參藥材粗粉(過(guò)2號(hào)篩)約1000 g，置于圓底燒瓶中，加入5倍量乙酸乙酯12 h脫脂，過(guò)濾，殘?jiān)鼡]干乙酸乙酯后充分干燥，即得脫脂的珠子參藥材。精密稱取脫脂的珠子參藥材50 g，加水500 mL，加纖維素酶4%，在50 ℃下超聲(200 W)20 min，過(guò)濾，濾液濃縮至100 mL后加95%乙醇至含醇量80%，4 ℃靜置過(guò)夜后抽濾，殘?jiān)靡颐押蜔o(wú)水乙醇抽濾脫色后冷凍干燥，即得珠子參多糖，稱定重量，記做M(g)。

精密稱取珠子參多糖10 mg至100 mL容量瓶中，加水充分溶解并稀釋至刻度即得供試品溶液。

2.1.2線性關(guān)系考察 將無(wú)水葡萄糖在105 ℃干燥至恒重后，精密稱取10 mg加水充分溶解，并定容于100 mL棕色量瓶中，得濃度為0.11 mg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液。

分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 置于10 mL具塞試管中，分別加水至2.0 mL，各加入5.0% 苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，置于沸水中水浴15 min，取出置于冷水中冷卻至室溫，于488 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.0576X+0.0293(r=0.9990)，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.0～13.75 μg·mL-1與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2多糖提取率的測(cè)定 采用硫酸-苯酚法測(cè)定。精密移取供試品溶液1.0 mL置于10 mL 具塞試管中，加1.0 mL水，用5.0%的苯酚和濃硫酸依次處理顯色，測(cè)定吸光度值，計(jì)算多糖濃度，并按照下列公式計(jì)算珠子參多糖提取率。

2.3單因素試驗(yàn)考察

2.3.1加水量 稱取5份脫脂珠子參藥材，每份約10 g，分別加入5、10、15、20、25倍量水，加纖維素酶4%，在50 ℃下超聲(200 W)20 min，過(guò)濾，濾液醇沉脫色后取10 mg珠子參多糖，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取率分別為4.42%、6.23%、6.75%、6.94%、7.12%，加水量15倍后珠子參多糖提取率基本穩(wěn)定，故選取15倍加水量進(jìn)一步考察其他因素，結(jié)果如圖1。

圖1 加水量與珠子參多糖提取率的關(guān)系

2.3.2纖維素酶用量 稱取5份脫脂珠子參藥材，每份約10 g，加150 mL水，分別加入1%、2%、3%、4%、5%的纖維素酶，在50 ℃下超聲(200 W)20 min，過(guò)濾，濾液醇沉脫色后取10 mg珠子參多糖，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取率分別為2.17%、3.42%、5.45%、6.74%、6.38%，選取4%纖維素酶進(jìn)一步考察其他因素。結(jié)果如圖2。

圖2 纖維素酶與珠子參多糖提取率的關(guān)系

2.3.3超聲溫度 根據(jù)纖維素酶的說(shuō)明，最佳使用溫度為45～55 ℃，故稱取3份脫脂珠子參藥材，每份約10 g，加150 mL水，加入4%的纖維素酶，在40 ℃、50 ℃和55 ℃條件下超聲(200 W)20 min，過(guò)濾，濾液醇沉脫色后取10 mg珠子參多糖，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取率分別為6.47%、6.76%、6.71%，在規(guī)定溫度內(nèi)纖維素酶的活力和珠子參多糖提取率基本穩(wěn)定，因此固定超聲溫度50 ℃，考察其他因素對(duì)珠子參多糖提取率的影響。結(jié)果如圖3。

圖3 超聲溫度與珠子參多糖提取率的關(guān)系

2.3.4超聲功率 稱取5份脫脂珠子參藥材，每份約10 g，加150 mL水，加入4%的纖維素酶，在50 ℃下超聲(100 W、150 W、200 W、250 W、300 W)20 min，過(guò)濾，濾液醇沉脫色后取10 mg珠子參多糖，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取率分別為5.84%，8.61%，6.58%，5.47%，4.92%，超聲功率的增加在一定范圍內(nèi)促進(jìn)珠子參多糖的溶出，但功率太大可能會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致提取率下降，故選取超聲功率150 W進(jìn)一步考察其他因素。結(jié)果如圖4。

圖4 超聲功率與珠子參多糖提取率的關(guān)系

2.3.5超聲時(shí)間 稱取5份脫脂珠子參藥材，每份約10 g，加150 mL水，加入4%的纖維素酶，在50 ℃下超聲(150 W)分別10 min、20 min、30 min、40 min、50 min過(guò)濾，濾液醇沉脫色后取10 mg珠子參多糖，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取率分別為4.23%、8.56%、9.84%、10.68%、10.74%，故選取超聲時(shí)間40 min進(jìn)一步考察。結(jié)果如圖5。

圖5 超聲時(shí)間與珠子參多糖提取率的關(guān)系

2.4正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定超聲溫度為50 ℃，選擇加水倍量、纖維素酶用量、超聲功率和超聲時(shí)間作為影響因素表見(jiàn)表1，正交設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果

由表3可知，超聲時(shí)間對(duì)珠子參多糖得率影響最大，其次是超聲功率，所選水平范圍內(nèi)加水倍量和纖維素酶的用量對(duì)珠子參多糖提取率影響不大。根據(jù)各因素的極差值R的影響大小，優(yōu)選的最佳工藝為A3B3C2D3，即脫脂后珠子參藥材加20倍量水，加5%纖維素酶，在50 ℃下超聲(150 W)50 min。

表3 方差分析結(jié)果

2.5提取工藝參數(shù)驗(yàn)證 按照正交試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批珠子參多糖，多糖提取率第一次為11.13%，第二次為10.47%，第三次為10.85%，平均提取率為10.81%，多糖提取率較穩(wěn)定，優(yōu)化的提取工藝實(shí)用可靠。

2.6珠子參多糖抗氧化活性研究 參考文獻(xiàn)的方法[12]精密稱取DPPH適量，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含40 μg的溶液，避光保存。分別配制珠子參多糖0.5，1，2，4，8和10 mg·mL-1系列不同濃度水溶液和Vc 0.5，1，2，4，8和10 mg·mL-不同濃度乙醇溶液，各取2 mL，加入DPPH乙醇溶液2 mL，在試管中混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處平行測(cè)定3次吸光度，記做Ai。以無(wú)水乙醇或超純水代替樣品溶液，用同樣的方法混勻、反應(yīng)，平行測(cè)定3次吸光度，記做A0。根據(jù)公式計(jì)算不同樣品的提取液對(duì)DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-Ai/AO]×100%。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 DPPH自由基清除率結(jié)果

珠子參多糖濃度在2 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到50%以上，且隨著珠子參多糖濃度的增強(qiáng)清除能力不斷增強(qiáng)，在8 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)80%以上，DPPH自由基的清除率最大達(dá)84.25%，但其清除自由基能力較等濃度的Vc較弱。

3 討論

多糖作為一種天然的高分子物質(zhì)，由于藥物體內(nèi)過(guò)程的認(rèn)識(shí)不斷更新，也越來(lái)越為人們認(rèn)識(shí)到其潛在的活性和研究?jī)r(jià)值[13-15]。多糖的提取工藝除了傳統(tǒng)的熱水提取法之外，隨著提取設(shè)備的不斷研發(fā)和對(duì)多糖性質(zhì)的不斷深入研究，超聲波輔助、微波輔助、酶輔助等手段都大大提升了多糖的提取效率[16-18]。多糖含量方面陜產(chǎn)珠子參優(yōu)于四川和云南等地的珠子參藥材[19]。珠子參多糖的分子量分布在103～105之間，單糖組成主要由葡萄糖和半乳糖組成[20-21]。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶輔助提取珠子參多糖工藝，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為脫脂后珠子參藥材加20倍量水，加5%纖維素酶，在50 ℃下超聲(150 W)50 min，驗(yàn)證試驗(yàn)表明在此條件下，所得珠子參多糖得率為10.81%，結(jié)果表明，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的珠子參多糖提取方法穩(wěn)定可行。通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定評(píng)價(jià)了珠子參多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果珠子參多糖在8 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率就已達(dá)到80%以上，具有良好的抗氧化活性，為其合理開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。