張麗華

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046)

白及,蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖，氣微，嚼之有黏性。白及在止血消腫方面有一定的作用，《吉人集驗(yàn)方》中記載，單味研末，糯米湯調(diào)服。它還可治療手足皸裂，研磨成粉后促進(jìn)傷口的愈合[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-7]，白及多糖具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等功效。白及多糖能夠收斂止血，促進(jìn)上皮組織修復(fù)，幫助傷口愈合等[8]，多作為醫(yī)藥原料、生物醫(yī)學(xué)材料和免疫調(diào)節(jié)劑[9]等。膜分離技術(shù)是一種采用選擇性滲透膜作為分離媒介，利用化學(xué)位差或外部能量作為推動(dòng)力的分離工藝技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對某一類物質(zhì)的分離、提純和濃縮[10-14]。膜分離技術(shù)能夠有效保留功效成分的活性，而且其選擇性強(qiáng)，操作過程簡單，適用范圍廣，能耗低，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)過程中[15-17]。陶瓷薄膜管壁上存在著許多微小的濾孔，在一定的壓力下，物質(zhì)在膜內(nèi)或膜外流動(dòng)，小分子或一些液體可以穿過薄膜，而大分子或固體無法穿過薄膜，從而實(shí)現(xiàn)對物質(zhì)的分離、純化和濃縮[18-20]。鑒于此，本研究采用膜分離技術(shù)分離純化白及多糖，降低多糖損失率，得到簡單、高效的多糖分離方法，為白及多糖進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 FA1004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(西安予輝儀器有限公司)；DS5紫外可見分光光度計(jì)(英國愛丁堡儀器公司)；DHG-9075型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；BSM-CMZ-01G型陶瓷膜分離設(shè)備(上海碧欣生物設(shè)備工程有限公司)。

1.2試藥 白及粗多糖為實(shí)驗(yàn)室自制，苯酚-硫酸法測定多糖含量為60%。無水乙醇(安徽安特食品股份有限公司，分析純)；苯酚(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，分析純)；濃硫酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

2 方法

2.1原料預(yù)處理 取實(shí)驗(yàn)室自制的白及多糖提取物，在40 ℃水浴下配制成相應(yīng)濃度的白及多糖溶液，用定性濾紙和布氏漏斗抽濾不溶物。

查閱眾多文獻(xiàn)可知，白及多糖的分子量存在多樣性，主要分子量分布在1×105～3×105之間，本研究選用50 kD的陶瓷膜進(jìn)行多糖分離工藝研究[21]。

2.2多糖含量的測定

2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品50 mg,精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)母液。在每次測量前，都要先用蒸餾水把母液稀釋成0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL的具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，依次加入5%的苯酚1 mL，5 mL的濃硫酸，搖勻，顯色反應(yīng)15 min后，在490 nm處測定吸光度值[22]。以未加入葡萄糖溶液的樣品作為空白，以溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=9.0458X-0.0084(r=0.9996)，葡萄糖在0.02～0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.2多糖的含量測定 應(yīng)用苯酚-硫酸法：精密吸取相應(yīng)濃度的多糖溶液1 mL，置于10 mL的具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)加至1 mL，然后再依次加入5%的苯酚溶液1 mL和5 mL的濃硫酸，搖勻，顯色反應(yīng)15 min后，測量在490 nm處的吸光度值，并計(jì)算出多糖的含量。

白及多糖回收率計(jì)算公式為 ：

注：C為白及多糖濾液的濃度(mg·mL-1)；V為白及多糖濾液的體積(mL)；m為預(yù)處理前的白及粗多糖質(zhì)量(g)。

2.3膜分離實(shí)驗(yàn)方法 用陶瓷膜分離設(shè)備(陶瓷膜分離流程示意圖見圖1)分別過濾各多糖溶液。

2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1溫度對多糖回收率的影響 先取備用液料液比為6 mg·mL-1的多糖溶液，再設(shè)定陶瓷膜分離設(shè)備膜壓為2.0 bar，沖洗次數(shù)為5次，分別在溫度為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃下，分離多糖溶液，收集濾液，采用苯酚-硫酸法測量多糖的回收率。

2.3.1.2料液比對多糖回收率的影響 設(shè)定陶瓷膜分離設(shè)備膜壓為2.0 bar，溫度45 ℃，沖洗5次，分別在料液比為2，4，6，8和10 mg·mL-1下，分離多糖溶液，收集濾液，采用苯酚-硫酸法測量多糖的回收率。

2.3.1.3膜壓對多糖回收率的影響 先取備用液料液比為6 mg·mL-1的多糖溶液，溫度45 ℃，沖洗5次，再分別設(shè)定陶瓷膜分離設(shè)備膜壓為1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 bar，分離多糖溶液，收集濾液，采用苯酚-硫酸法測量多糖的回收率。

2.3.1.4沖洗次數(shù)對多糖回收率的影響 先取備用液料液比為6 mg·mL-1的多糖溶液，設(shè)定膜壓2.0 bar，溫度45 ℃，沖洗次數(shù)分別為1、2、3、4、5，分離多糖溶液，收集濾液，采用苯酚-硫酸法測量多糖的回收率。

1.料液貯罐;2.緩沖罐;3.壓力表;4.溫度表;5.透過液流量計(jì);6.循環(huán)液流量計(jì);7.膜組件;8.截止閥;9.蠕動(dòng)泵;10.箱體

2.3.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖回收率為考察指標(biāo)，并利用Box-Behnken[24]的基本原理，篩選出三個(gè)對多糖回收率有重要影響的因素：料液比(A)、溫度(B)、膜壓(C)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定膜分離白及多糖的最佳工藝，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1溫度對多糖回收率的影響 多糖回收率與溫度的變化關(guān)系如圖2所示，曲線從30 ℃到45 ℃時(shí)一直呈上升趨勢，45 ℃后略微下降。當(dāng)溶液溫度為45 ℃時(shí)，多糖回收率達(dá)到最大，然而當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，多糖回收率逐漸減小。過高的溫度不僅會(huì)對白及多糖的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，還會(huì)影響膜裝置的使用壽命，所以溶液溫度為45 ℃左右較為理想，此時(shí)多糖回收率最大。

圖2 溫度的影響

3.1.2料液比對多糖回收率的影響 多糖回收率與料液比的變化關(guān)系如圖3所示，曲線從開始一直呈上升趨勢，當(dāng)料液比為6 mg·mL-1時(shí)，白及多糖回收率達(dá)到最大，6 mg·mL-1后呈緩慢下降趨勢。這主要是由于隨著料液比的增大，膜的表面的凝膠層及流動(dòng)邊界層厚度減小，而濃差極化作用減弱，從而提高了多糖回收率。當(dāng)料液比增加到6 mg·mL-1后，多糖回收率基本趨于穩(wěn)定。然而當(dāng)物質(zhì)-液體的比率持續(xù)增加時(shí)，溶液的黏度也會(huì)增大，阻力也在增加，因?yàn)橐恍┤苜|(zhì)沉積在膜的表面，很容易堵塞膜孔，膜孔堵塞就使液體難以通過膜，增大了溶液通過膜界面的阻力，從而導(dǎo)致多糖回收率下降。因此，選擇料液比為6 mg·mL-1左右較為合適。

圖3 料液比的影響

3.1.3膜壓對多糖回收率的影響 多糖回收率與膜壓的變化關(guān)系如圖4所示，從1.0 bar膜壓增大，曲線呈明顯上升趨勢，當(dāng)膜壓為2.0 bar時(shí)，多糖回收率達(dá)到最大，之后趨于平緩。這主要是因?yàn)槟さ膲毫υ龃螅し蛛x的推動(dòng)力增強(qiáng)，多糖就比較容易透過膜。隨著壓力的升高，造成了許多大分子溶質(zhì)的吸附和積聚，膜的表面堆積了許多難以讓溶液持續(xù)透過的物質(zhì)，使得凝膠層的厚度和密度增加，膜被壓密，從而使傳質(zhì)阻力增加，影響了多糖的回收率。因此，膜壓為2.0 bar左右較合適。

圖4 膜壓的影響

3.1.4沖洗次數(shù)對多糖回收率的影響 多糖回收率和沖洗次數(shù)的變化關(guān)系如圖5所示，隨著沖洗次數(shù)的增加，多糖回收率呈上升趨勢，當(dāng)沖洗次數(shù)達(dá)到5次時(shí)，多糖回收率達(dá)到了82.5%。這是因?yàn)槟ぴ谑褂眠^程中，凝膠極化使膠體層的厚度增加，同時(shí)，溶質(zhì)在膜的表面形成了吸附層而堵塞膜孔，所以多次沖洗膜表面對于清理膜孔有著十分重要的作用，膜孔疏通才有利于提高多糖的回收率。

圖5 沖洗次數(shù)的影響

3.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果,按照Box-behnken[24]方法設(shè)計(jì)的原理,主要考察的因素為液料比(A)、溫度(B)、膜壓(C)，多糖回收率為響應(yīng)值,試驗(yàn)中的設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

應(yīng)用Design-Expert 12.0.3軟件進(jìn)行了數(shù)據(jù)的分析，響應(yīng)變量為液料比(A)、溫度(B)、膜壓(C)，響應(yīng)值為多糖回收率(Y)，按照所設(shè)計(jì)的響應(yīng)面方案進(jìn)行試驗(yàn)，并對所得到的試驗(yàn)結(jié)果通過回歸擬合分析后得到方程為：

Y=78.44-0.900A+3.4B+1.23C-2.35AB-1.90AC+1.35BC-8.65A2-6.34B2-6.44C

通過上表可以看出，回歸模型顯著(P<0.05)失擬誤差的值為0.2206，是不顯著因素，方程中的A2的影響結(jié)果為極顯著，B和AB的影響結(jié)果為顯著。結(jié)果表明模型r=0.9858，radj=0.9673，均接近1.0，這說明該回歸模型線性關(guān)系良好，與實(shí)際結(jié)果具有高度相關(guān)性，可準(zhǔn)確反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其可信度較好；而它的變異系數(shù)CV=2.80%<5.0%，由此可以看出，模型外因素對響應(yīng)值的影響不明顯，可以考慮將該模型用在對實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測上。

3.2.2響應(yīng)曲面分析 料液比和溫度、料液比和膜壓、溫度和膜壓這幾個(gè)因素交互影響的顯著差異如圖6所示。由響應(yīng)面圖可得，膜壓和溫度以及料液比各單因素之間交互影響，存在顯著性差異，當(dāng)?shù)玫降捻憫?yīng)面圖傾斜程度越低，坡度較緩，等高線越趨于圓形時(shí)，則兩個(gè)單因素交互影響越??；反之，則兩個(gè)單因素間的交互影響顯著。由圖6可看出，這三個(gè)單因素之間的交互影響均較大，三個(gè)因素對應(yīng)的曲線當(dāng)中，變化最大的、最陡峭的是溫度的變化曲線，膜壓次之，料液比最小。

(a) 料液比、溫度的影響 (b)料液比、膜壓的影響 (c) 溫度、膜壓的影響

對回歸方程求一階偏導(dǎo)，由此可得白及多糖的膜分離最佳工藝條件為：溫度46.519 ℃、料液比5.781 mg·mL-1、膜壓2.072 bar，白及多糖的回收率達(dá)79.092%。綜合考慮預(yù)測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際操作工藝條件，微調(diào)工藝參數(shù)為溫度為47℃、料液比6 mg·mL-1、膜壓2 bar，在此工藝條件下重復(fù)操作三次，得到的多糖回收率平均都在78.44%，這說明可以用此模型來分析和預(yù)測白及多糖的膜分離工藝。

4 總結(jié)與討論

本研究以白及多糖為原料，以白及多糖的回收率為指標(biāo)，采用膜分離純化白及多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇響應(yīng)面法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為：溫度47 ℃，料液比6 mg·mL-1，膜壓2 bar，白及多糖的回收率達(dá)78.44%。本研究對白及多糖的分離純化起到了較好的效果，為白及多糖的進(jìn)一步研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

多糖的分離方法有多種，本研究采用膜分離工藝，具有以下優(yōu)勢：操作簡便、分離效率高、環(huán)境污染小、能耗低、節(jié)約資源等。在實(shí)際生產(chǎn)中，膜分離根據(jù)分離物質(zhì)的孔徑進(jìn)行分離，具有較強(qiáng)的選擇濾過性，同時(shí)分離過程中會(huì)造成有效物質(zhì)有一定的損失，需要根據(jù)不同的情況對工藝進(jìn)行合理的選擇。隨著制劑工藝的發(fā)展，對多糖分離的效率和品質(zhì)有了更高的要求，我們也要與時(shí)俱進(jìn)，不斷創(chuàng)新，引入新技術(shù)新方法充實(shí)該領(lǐng)域，探索出更加穩(wěn)定高效的多糖分離方法。