胡華杰 郭燕娜 周?chē)?guó)兒# 張雷芳

1 舟山市中醫(yī)院 浙江 舟山 316000

2 浙江海洋大學(xué) 浙江 舟山 316000

長(zhǎng)期以來(lái)，浙貝母植株都是以鱗莖入藥，其花和地上部分常常被作為廢物丟棄[1]。近年來(lái)，研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)浙貝母花除含有與其鱗莖中相似的生物活性物質(zhì)如生物堿和皂苷外，還含有黃酮類、脂肪酸、氨基酸等成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[2-4]。此外，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)其具有潛在的抗氧化和抗自由基作用[5]，具有廣闊的資源利用空間。如果對(duì)這些廢棄的浙貝母花資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，不僅可以有效提高浙貝母的利用率，而且能大大增加種植浙貝母的農(nóng)業(yè)收益，提高人們的種植積極性，對(duì)于傳統(tǒng)中藥開(kāi)發(fā)和發(fā)展也具有借鑒意義。

本研究以浙貝母花乙醇提取物為研究對(duì)象，初步探討其體內(nèi)抗氧化作用，為浙貝母花的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為后期深入研究浙貝母花抗氧化作用的有效成分奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：水流抽氣機(jī)A-1000S、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100均購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1600購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9240 A購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；落地式超純水機(jī)UPT-II-60L購(gòu)自上海四科儀器設(shè)備有限公司；電磁爐C21-RH2014購(gòu)自美的電器集團(tuán)有限公司；渦旋振蕩器Votlex-genie 2購(gòu)自上海革冉儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試劑：浙貝母花采自浙江省舟山市金塘鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母（Fritillariae thunbergii Miq.）的花；維生素C（批號(hào)：ST1434）、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；硫酸亞鐵、葡萄糖、氯化鈉、無(wú)水乙醇、碳酸鈣均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 浙貝母花乙醇提取物的制備：稱取自然干燥后粉碎的浙貝母花100g，加800mL 70%乙醇超聲波提取3次，每次3h，抽濾，合并濾液，在減壓條件下回收乙醇，烘干，即為浙貝母花乙醇提取物。

2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定：稱取4.0mg的DPPH，加無(wú)水乙醇溶解，置100mL棕色容量瓶中，制備得到濃度為0.08mol/L的DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。分別吸取不同濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，單位：mg/mL)的樣品溶液2.0mL到10mL的離心管中，再分別加入3.0mLDPPH溶液，在室溫、避光條件下反應(yīng)30min，蒸餾水為空白對(duì)照組，于517nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定它們的吸光值，計(jì)算DPPH自由基清除率，公式如下。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=［A0-(AS-AC)］/A0×100%

A0：2.0mL蒸餾水+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AS：2.0mL樣品溶液+3.0mL DPPH溶液的吸光度值

AC：2.0mL樣品溶液+3.0mL蒸餾水的吸光度值

2.3 動(dòng)物分組及給藥：ICR小鼠50只，雄性，體質(zhì)量28～30g(杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證編號(hào)：20210412Abzz0105999541)，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下(24±2℃溫度、75%濕度和12h光-暗循環(huán))飼養(yǎng)一周，自由進(jìn)食、飲水。將小鼠隨機(jī)分為正常組、陽(yáng)性對(duì)照（VC）組和浙貝母花乙醇提取物高劑量組（0.8g/kg）、中劑量組（0.4g/kg）及低劑量組（0.2g/kg），每組10只。將浙貝母花乙醇提取物的干浸膏用少量0.5%CMC-Na溶解后，加入去離子水配成懸浮液進(jìn)行灌胃給藥，1次/d。陽(yáng)性組使用0.03g/kg的維生素C進(jìn)行灌胃，正常組使用等體積的0.5%CMC-Na水溶液灌胃，連續(xù)給藥14d。

2.4 血清及肝、腦組織勻漿的制備：實(shí)驗(yàn)最后一次給藥24h之后，眼球取血，3500rpm離心15min，分離得上層血清用于進(jìn)一步分析?？焖賹⑿∈筇幩啦⒔馄?，剝離得到肝臟以及腦組織，使用預(yù)冷的生理鹽水對(duì)肝臟及腦組織沖洗數(shù)次，放置于白色操作臺(tái)上拍照取證，再用其制成濃度為10%的組織勻漿，3500rpm離心10min，分離得上層血清用于進(jìn)一步分析。

2.5 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定：按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清、腦組織、肝組織勻漿中的T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)均以（±s）表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 體外DPPH自由基的清除率：由圖1可知，浙貝母花乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增加，兩者呈正比關(guān)系。當(dāng)濃度為0.8mg/mL時(shí)，清除率超過(guò)50%。當(dāng)濃度為1.0mg/mL時(shí)清除率達(dá)到了59.28%。結(jié)果表明，浙貝母花乙醇提取物具有較好的體外自由基清除力，并具有潛在的體內(nèi)抗氧化活性。

圖1 不同濃度浙貝母花乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率

2.8 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX影響：由圖2可知，浙貝母花的乙醇提取物可以顯著提高小鼠血清中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組改善最為明顯（P＜0.05）。

圖2 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠血清中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

2.9 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠腦組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX的影響：由圖3可知，浙貝母花乙醇提取物能夠提高小鼠腦組織中的T-SOD、CAT和GSH-PX的活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組的改善更明顯（P＜0.05）。

圖3 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠腦中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

2.10 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠肝組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH-PX活性水平的影響：由圖4可知，浙貝母花的乙醇提取物可以提高小鼠肝組織中的T-SOD、CAT和GSH-PX活性，降低MDA的水平，且中、高劑量組改善更明顯（P＜0.05）。

圖4 浙貝母花乙醇提取物對(duì)小鼠肝臟中T-SOD、MDA、CAT、GSH-PX的影響

3 討論

正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但如果自由基產(chǎn)生過(guò)快或清除過(guò)慢，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，甚至?xí)T發(fā)諸多疾病，例如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、糖尿病以及與衰老相關(guān)的退行性過(guò)程[6-10]?？寡趸瘎┠軌蛴行У厍宄杂苫箼C(jī)體免受自由基的損傷，受到廣泛應(yīng)用。目前所使用的抗氧化劑多是人工合成，攝入過(guò)多會(huì)產(chǎn)生毒副作用，存在安全隱患[11]。天然抗氧化劑由于對(duì)機(jī)體的安全性高、無(wú)副作用且自身抗氧化能力強(qiáng)等特點(diǎn)愈來(lái)愈受到重視[12]，因此從植物中研究提取天然抗氧化劑具有重要意義。

DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來(lái)自3個(gè)苯環(huán)的π-π共軛作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對(duì)的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，DPPH可以捕獲其他的自由基。因此通過(guò)加入DPPH后觀察某一化學(xué)反應(yīng)的速率是否減慢，來(lái)作為這一反應(yīng)是否具有自由基反應(yīng)本質(zhì)的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中我們利用超聲提取法制備浙貝母花乙醇提取物，測(cè)定了DPPH自由基的清除率，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)其抗氧化作用進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，浙貝母花乙醇提取物具有較好的體外自由基清除力，中、高劑量組能夠降低小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，升高SOD、CAT、GSH-PX的含量，具有較好的體內(nèi)抗氧化活性。下一步，課題組擬對(duì)浙貝母花乙醇提取物抗氧化的作用機(jī)制和其他提取物的抗氧化作用進(jìn)行研究，為浙貝母花的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供可行性基礎(chǔ)。