安依凡，李 斌，張宗錦，楊章明，陳壽明，閆芳芳，安德榮*

(1.西北農(nóng)林科技大學植物保護學院植物病毒和資源微生物實驗室，陜西楊凌 712100；2.中國煙草總公司四川省公司，四川成都 610000；3.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川攀枝花 617000)

富集培養(yǎng)微生物的意義主要包括獲得相當數(shù)量的目標微生物進而制作微生物劑，用以改良土壤生物與防治病害[1]；也包括獲得相當數(shù)量的微生物代謝產(chǎn)物進而制作化學劑，用以制藥[2]、保健品[3]等；還可以包括明確益生元進而制作益生元微生物助劑，用以改善宿主健康[4]。芽孢桿菌是一類能產(chǎn)生內生孢子的細菌，芽孢桿菌形成的孢子具有很強的耐高溫、抗干旱特征，現(xiàn)已廣泛應用于農(nóng)業(yè)植物保護領域。芽孢桿菌LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物可以作為芽孢桿菌固體粉劑生產(chǎn)過程中的接種劑，也可以作為液體水劑生產(chǎn)過程中的待放大環(huán)節(jié)。綜述西北農(nóng)林科技大學植物保護學院植物病毒和資源微生物實驗室對4株芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌1號、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5、解淀粉芽孢桿菌YF-6的研究結果，旨在為其開發(fā)利用提供參考。

1 4種芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)與應用

1.1 4種芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)1835年Ehrenberg發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌，并將其命名為“Vibriosubtilis”。1872年隨著細菌分類系統(tǒng)的建立，Cohn又將其命名為“Bacillussubtilis”?？莶菅挎邨U菌隸屬于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，作為芽孢桿菌科的模式菌株，菌體呈桿狀，無莢膜，周生鞭毛能運動，是自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性菌[5]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)首先由日本學者Fukomoto于1943年發(fā)現(xiàn)并提出，他發(fā)表了分泌淀粉酶細菌的分離及分布的研究報告，報告指出解淀粉芽孢桿菌可以分泌細菌淀粉酶。英國學者Priest等[6]于1987年證明了Bacillusamyloliquefaciens這一名稱的有效性并指出Bacillusamyloliquefaciens的參照菌株為ATCC 23350。

2005年，西班牙科學家Ruiz-García等[7]從西班牙南部馬拉加貝萊斯河采集的苦咸水樣品中分離得到2個菌株CR-14b和CR-502T，它們能夠合成大量的脂肽類物質并產(chǎn)生抗菌活性。Ruiz-García將其命名為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)并在IJSEM(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology《國際系統(tǒng)與進化微生物學期刊》)上合格發(fā)表。

2010年，來自韓國忠北大學和新加坡國立大學的學者Munusamy Madhaiyan從水稻的根際土壤分離出了細菌CBMB205，并觀察到它的運動。該細菌革蘭氏染色呈陽性，嚴格需氧，桿狀有鞭毛，具內生孢子，在30 ℃、pH 7.0環(huán)境下添加600 mmol/L甲醇的AMS營養(yǎng)基培養(yǎng)下它的生長達到最佳。該細菌被鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)[8]。

1.2 4種芽孢桿菌不同菌株的應用枯草芽孢桿菌Y25能夠降低百合枯萎病發(fā)病率[9]，枯草芽孢桿菌Bv17能夠大幅度降低非洲菊根腐病病情指數(shù)[10]，枯草芽孢桿菌Bs-15能夠較好防治柿樹炭疽病[11](微生物劑)；枯草芽孢桿菌8-2可以產(chǎn)出γ-聚谷氨酸[12]，枯草芽孢桿菌M364可以產(chǎn)出抗菌肽Bacillomycin D[13](化學劑)；枯草芽孢桿菌ACCC11025在0.8 mg/mL白術多糖助劑下顯著增殖[14]，枯草芽孢桿菌KCTC 2217在低聚果糖(fructooligosaccharide)助劑下可使日本鰻鱺顯著增重[15](益生元微生物助劑)。

解淀粉芽孢桿菌CRJ-9能夠有效控制辣椒疫病的發(fā)生和蔓延[16]，解淀粉芽孢桿菌Ba168能夠突出防治棉花黃萎病[17](微生物劑)；解淀粉芽孢桿菌HRH317可以產(chǎn)出抗菌蛋白[18]，解淀粉芽孢桿菌Y11可以產(chǎn)出淀粉酶[19]，解淀粉芽孢桿菌Tu-115可以產(chǎn)出纖維素酶[20](化學劑)。

貝萊斯芽孢桿菌S6能夠較好防治番茄早疫病[21]，貝萊斯芽孢桿菌WK1對水稻紋枯病的防治效果穩(wěn)定(與5%井岡霉素水劑防效相當)[22]，貝萊斯芽孢桿菌TCS001可顯著抑制黃瓜灰霉病病斑生長并能顯著降低黃瓜白粉病病情指數(shù)[23](微生物劑)；貝萊斯芽孢桿菌DH82可以產(chǎn)出抗菌粗蛋白[24]，貝萊斯芽孢桿菌P9可以產(chǎn)出纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶[25](化學劑)。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌MY1能夠很好預防和治療番茄灰霉病且與對照試劑腐霉利防效間沒有顯著差異[26]，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌265ZY3可作為復配菌肥菌種良好預防馬鈴薯干腐病[27](微生物劑)；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BM47可以產(chǎn)出羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)[28]，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌DCS1可以產(chǎn)出堿性淀粉酶(alkaline amylase)、生物表面活性劑(biosurfactant)[29](化學劑)。

2 4株芽孢桿菌形態(tài)及其應用特性數(shù)據(jù)

2.1 4株芽孢桿菌的菌株形態(tài)該實驗室的芽孢桿菌菌株有4種：枯草芽孢桿菌1號、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5和解淀粉芽孢桿菌YF-6，菌株形態(tài)如圖1所示。

圖1 4株芽孢桿菌的菌株照片

枯草芽孢桿菌1號斜面底部褶皺較多，褶皺呈包圍狀；表面均勻，沙灘黃色；挑起時比較容易，濕度小。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6斜面底部褶皺非常多，褶皺呈放射狀；表面布有垂直于生長方向的褶皺，暖灰色；挑起時局部完整性較高。貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5斜面底部褶皺較少，菌落易在菌株生長輪廓處積累；表面不夠均勻，土黃色；挑起時易與培養(yǎng)基粘連。解淀粉芽孢桿菌YF-6斜面底部褶皺較少，菌株邊沿光滑無積累；表面均勻且易反光，奶白色；挑起時黏稠但局部完整性較差。

2.2 4株芽孢桿菌的應用特征數(shù)據(jù)枯草芽孢桿菌1號能夠減少作物土傳病害、提高作物成活率、改善土壤團粒結構、抑制有害菌?？莶菅挎邨U菌是該實驗室的研究方法模板菌株。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6對番茄灰霉病菌、稻瘟病菌有較強生防效果，LB液體培養(yǎng)基無菌發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的菌絲生長抑制率為95.34%，EC50為10.18 mL/L；對稻瘟病菌的菌絲生長抑制率為92.56%，EC50為10.84 mL/L；LB液體培養(yǎng)基無菌發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)抑制率為93.98%，EC50為2.03 mL/L；對稻瘟病菌的孢子萌發(fā)抑制率為92.09%，EC50為2.67 mL/L[30]。

貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對一些作物真菌病菌有較好的抑菌帶寬，對棉花枯萎病菌抑菌帶寬為(15.1±0.1)mm、對西瓜炭疽病菌抑菌帶寬為(11.97±0.15)mm、對馬鈴薯早疫病菌抑菌帶寬為(11.43±0.59)mm、對玉米大斑病菌抑菌帶寬為(11.40±0.53)mm。貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對煙草K326赤星病相對防效可達(77.78±5.75)%。

解淀粉芽孢桿菌YF-6對一些作物病菌也有較好的抑菌帶寬，對辣椒疫霉病菌抑菌帶寬為(7.04±0.26)mm、對蘋果炭疽病菌抑菌帶寬為(10.54±0.26)mm、對棉花枯萎病菌抑菌帶寬為(9.64±0.35)mm、對玉米大斑病菌抑菌帶寬為(10.45±0.42)mm。9×106cfu/mL的解淀粉芽孢桿菌YF-6的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵液可以有效防止延安1號煙草赤星病的發(fā)生，且對延安1號煙草有促進生長的作用。

2.3 4株芽孢桿菌的生長曲線枯草芽孢桿菌1號的發(fā)酵生長曲線可以分為遲緩期、增多適應期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個階段。由圖2可知，生長曲線在2～14 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在14～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；在32～60 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在60～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.095 8；在穩(wěn)定期的72 h達到最大值，最大值為2.156。選擇快速增多期推算世代時間T，經(jīng)計算，T枯草芽孢桿菌1號=2.17 h。

圖2 4株芽孢桿菌的發(fā)酵生長曲線

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6的發(fā)酵生長曲線也可以分為遲緩期、增多適應期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個階段。由圖2可知，生長曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；32～52 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在52～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.087 5；在穩(wěn)定期的56 h到達最大值，最大值為2.279。選擇快速增多期推算世代時間T，經(jīng)計算，T甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6=2.24 h。

貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5的發(fā)酵生長曲線同樣可以分為遲緩期、增多適應期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個階段。由圖2可知，生長曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應期；在22～28 h，菌量增多快速，為快速增多期；28～56 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在56～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.105 2；在穩(wěn)定期的56 h到達最大值，最大值為2.049。選擇快速增多期推算世代時間T，經(jīng)計算，T貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5=3.96 h。

與前3株芽孢桿菌相同，解淀粉芽孢桿菌YF-6的發(fā)酵生長曲線可以分為遲緩期、增多適應期、快速增多期、穩(wěn)定增多期、穩(wěn)定期5個階段。生長曲線在2～12 h，菌量無明顯增多，為遲緩期；在12～22 h，菌量增多先快后慢，為增多適應期；在22～32 h，菌量增多快速，為快速增多期；在32～52 h，菌量穩(wěn)定增多，為穩(wěn)定增多期；在52～96 h，菌量無明顯變化，為穩(wěn)定期。生長曲線在快速增多期斜率最大，斜率近似等于0.090 2；在穩(wěn)定期的84 h到達最大值，最大值為2.355。選擇快速增多期推算世代時間T，經(jīng)計算，T解淀粉芽孢桿菌YF-6=2.68 h。

4株芽孢桿菌不同生長時期末期參數(shù)如表1所示。

表1 4株芽孢桿菌不同生長時期末期OD600吸光度值

3 結語

抑菌譜顯示甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、解淀粉芽孢桿菌YF-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5對作物真菌性病害病原菌均有良好的拮抗作用。在煙草病害防治方面，枯草芽孢桿菌1號、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6已投入煙草黑脛病、煙草根黑腐病等煙草根莖類病害的防治工作，解淀粉芽孢桿菌YF-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5已投入煙草赤星病病害的防治工作。

根據(jù)發(fā)酵生長曲線和對發(fā)酵現(xiàn)象的觀察，推測以獲得微生物劑為目標的發(fā)酵適宜在純凈且活躍的快速增多期取樣，以獲得化學劑為目標的發(fā)酵可以在復雜且強烈的穩(wěn)定期取樣；對以獲得微生物助劑為目標的發(fā)酵，建議在明確益生元的前提下，改良營養(yǎng)基?？莶菅挎邨U菌1號、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌lw-6、貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5、解淀粉芽孢桿菌YF-6均有發(fā)酵遲緩期、增多適應期、快速增多期、穩(wěn)定增多期和穩(wěn)定期?？焖僭龆嗥诩毦拇x活性、酶活性高而穩(wěn)定，大小比較一致，生活力強，因而廣泛地在生產(chǎn)上被用作“種子”和在科研上作為理想的試驗材料。找出4株芽孢桿菌的快速增多期對生產(chǎn)過程中的接種環(huán)節(jié)有參考意義，它可以縮短下一個發(fā)酵周期的延遲期從而縮短發(fā)酵周期，提高經(jīng)濟效益。