陳思霖，李 謙，包小敏，王劉倩，閆晶晶，季 迪 綜述，鄧安春 審校

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400037)

目前普遍認為，在惡性腫瘤的早期發(fā)生及其發(fā)展演化過程中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM)通過釋放多種細胞因子，對腫瘤血管及淋巴管形成、腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面造成影響，且TAM的數(shù)量與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后間也存在密切聯(lián)系[1]。近年來國內(nèi)外研究者高度關(guān)注在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中TAM的動態(tài)變化、表型、信號傳導(dǎo)通路和功能狀態(tài)，為探究頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)發(fā)病機制和尋求靶向TAM治療方案提供了可行的啟示和方法。

1 TAM的起源和類型

目前，有關(guān)巨噬細胞來源的普遍共識是：一方面可能來源于人類早期胚胎前體祖細胞，在胚胎生長發(fā)育過程中，播種到周圍組織而產(chǎn)生的獨立種群；另一方面是從成人造血干細胞衍生的循環(huán)單核細胞[2]。近年來，F(xiàn)RANKLIN等[3]又提出，TAM在腫瘤組織中可分為組織駐留的TAM和腫瘤誘導(dǎo)的TAM。腫瘤細胞產(chǎn)生的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)，主要發(fā)揮募集巨噬細胞并將其誘導(dǎo)成TAM的作用，通過與其受體M-CSFR結(jié)合，將巨噬細胞募集到腫瘤間充質(zhì)中并改變自身表型，以適應(yīng)它們所處的微環(huán)境[4]。另外，細胞外基質(zhì)所產(chǎn)生的透明質(zhì)酸、凝血因子X、內(nèi)皮缺氧誘發(fā)因子1α等在許多實體惡性腫瘤中也起到募集TAM的作用。

TAM包括經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型TAM的主要功能是破壞病原體并驅(qū)動1型T輔助細胞反應(yīng)，對微生物和腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒作用。當巨噬細胞受到白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)等刺激時[5]，會促使其向M2型TAM極化，進而分化為M2a、M2b和M2c三種亞型，發(fā)揮促進血管新生、分泌免疫抑制因子及促進腫瘤生長的作用。TAM的兩種極化狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中是可以相互轉(zhuǎn)化的。在惡性腫瘤發(fā)生的早期，腫瘤微環(huán)境中浸潤的M1型TAM能提高免疫效應(yīng)，起到抗癌作用；而在惡性腫瘤進展的晚期，TAM通常轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，促進癌細胞的生長[6]。

2 TAM在HNSCC中的作用

HNSCC的高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是其主要治療難點。眾所周知，機體的自身免疫系統(tǒng)雖然能夠識別并清除腫瘤細胞，但由于腫瘤細胞自身的低免疫原性及分泌多種免疫抑制因子的特性，使其可以逃避免疫系統(tǒng)的識別。在利用免疫組化探索TAM與HNSCC的臨床相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，M2型TAM通常高表達CD68和CD163兩種標記物[7]，且其數(shù)量與HNSCC患者的無進展生存期、無遠處轉(zhuǎn)移生存期和總生存期呈負相關(guān)。這意味著TAM可能在協(xié)助HNSCC逃避免疫監(jiān)視、促進腫瘤血管及淋巴管生成、刺激腫瘤增殖、促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[8]。

2.1 TAM的免疫抑制作用

巨噬細胞是腫瘤內(nèi)的主要吞噬細胞群，也是專業(yè)的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)，通過利用其吞噬功能可以在先天性免疫和獲得性免疫防御間形成紐帶，將處理后的抗原信息提呈給幼稚T細胞，促進T細胞活化[9]。而癌細胞通常廣泛表達一些“不要吃我”的信號，包括程序性細胞凋亡1配體(programmed cell death legend 1，PD-L1)、CD47、CD24、β2-微球蛋白等多種配體，起到破壞巨噬細胞吞噬能力的作用。研究表明，在抗原提呈的同時，TAM也像腫瘤細胞那樣可以表達PD-L1，并與T細胞上的PD-1結(jié)合，從而降低T細胞活化并誘導(dǎo)其凋亡[10]。此外，TAM還能表達另外一些檢查點配體，包括PD-L2、共抑制分子B7-H4和T細胞活化V結(jié)構(gòu)域Ig抑制劑(V-domain Ig suppressor of T-cell activation，VISTA)，起到抑制T細胞增殖的作用[11]。同時，TAM還能有效降低自然殺傷(natural killer，NK)細胞的抗腫瘤效應(yīng)。NK細胞作為固有免疫細胞成員之一，既能夠直接殺傷腫瘤細胞，又能分泌干擾素-γ(interferon,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等細胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，從而發(fā)揮間接抗腫瘤效應(yīng)[12]。然而在腫瘤發(fā)展過程中，由于腫瘤細胞本身可以逃逸NK細胞的識別，加之TAM分泌的多種細胞因子可以改變腫瘤微環(huán)境而干擾NK細胞活化甚至誘導(dǎo)其凋亡，使得NK細胞的抗腫瘤活性被抑制。如TAM表達的PD-L1便可誘導(dǎo)NK細胞凋亡[13]，降低對腫瘤細胞的直接殺傷作用。此外也有研究指出TAM可以通過抑制NK細胞中IFN-γ、TNF-α的表達[14]，間接降低其抗腫瘤活性。

2.2 TAM促進血管和淋巴管生成

TAM可以促進腫瘤血管生成，一方面TAM通過分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和組織蛋白酶可以降解基底膜，產(chǎn)生血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)；另一方面，通過激活血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(VEGFR)的表達，促使其與VEGF結(jié)合而促進血管生成，為維持腫瘤細胞的生長提供必要的血管網(wǎng)絡(luò)[15]。同時，MMP還可降解腫瘤細胞周圍的組織基質(zhì)，釋放肝素結(jié)合生長因子，如VEGF-A，誘導(dǎo)血管新生。TAM通過旁分泌作用和細胞自治模式在腫瘤源性淋巴管的生成中起到至關(guān)重要的作用，前者與TAM在腫瘤血管生成中發(fā)揮的作用相似，表現(xiàn)為大量VEGF、MMP等血管生成因子的分泌，后者則通過將巨噬細胞源性淋巴管內(nèi)皮細胞整合進入淋巴管，形成淋巴管內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cells，LEC)[16]。已有研究表明下調(diào)腫瘤組織中MMP-2的水平可以降低淋巴管生成和抑制LEC的侵襲能力[17]。此外，TAM還可分泌多種纖溶蛋白酶原激活物，調(diào)節(jié)基質(zhì)重塑和生長因子激活，從而促進腫瘤淋巴管的形成[18]。

2.3 TAM促進腫瘤細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移

TAM的浸潤與腫瘤細胞增殖關(guān)系密切。在惡性腫瘤細胞與巨噬細胞的體外共同培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞可分泌多種細胞因子來促進腫瘤細胞增殖；在去除巨噬細胞的體內(nèi)實驗中也證實，不同的腫瘤細胞生長都依賴于TAM的存在[19]。研究發(fā)現(xiàn)，TAM表達的上皮生長因子(epiderma1 growth factor，EGF)、上皮生長因子受體(EGFR)家族、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、TGF-β1等多種細胞因子可以促進腫瘤細胞增殖、維持腫瘤細胞存活[20]。同時TAM分泌的這些細胞因子對細胞外基質(zhì)有破壞作用，進而促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)是腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要步驟。TAM既可以表達TGF-β、IL-6等多種因子來誘導(dǎo)EMT，又能夠分泌EGF樣配體，激活腫瘤細胞中的EGFR通路來促進EMT[22]。在HNSCC中，TAM分泌的EGF2可以上調(diào)趨化因子C-C基序配體2(C-C motif ligand 2，CCL2)的表達，從而招募更多炎性單核細胞，并將其誘導(dǎo)成M2型TAM，形成正反饋旁分泌環(huán)路，促進EMT[23]。TAM釋放CCL18可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化，引起腫瘤細胞間連接作用減弱甚至喪失，以增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。另外， TAM還可產(chǎn)生高水平的炎性因子，如巨噬細胞遷移抑制因子，可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、形態(tài)變化和運動性來增加其侵襲性[8]。

3 針對TAM的治療策略

鑒于TAM在腫瘤微環(huán)境中的重要作用，國內(nèi)外研究者正積極探索針對TAM的相關(guān)治療策略，這些治療策略大致可分為：清除TAM，抑制TAM募集，激活TAM吞噬活性，TAM的重編程及嵌合抗原受體巨噬細胞療法。

3.1 清除TAM

清除TAM可以通過降低血液中單核細胞的數(shù)量及減少腫瘤組織中巨噬細胞的數(shù)量來實現(xiàn)。傳統(tǒng)上用來防止骨轉(zhuǎn)移或過度骨吸收的雙膦酸鹽，可以誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，但它對于髓系細胞也具有毒性反應(yīng)[24]。因而在此基礎(chǔ)上研制的第三代含氮雙膦酸鹽唑來膦酸(zoledronate，ZA)，被證實對表達MMP-9的TAM具有選擇性細胞毒作用，在多種臨床前腫瘤模型中，均可抑制單核細胞向TAM的分化，降低TAM的浸潤，進而減少腫瘤血管生成，抑制腫瘤進展[25]。近年來對于集落刺激因子-1(CSF-1)的研究發(fā)現(xiàn)，其表達可以控制循環(huán)單核細胞及組織巨噬細胞的生存、增殖、分化和趨化。利用單克隆抗體或小分子抑制劑可以阻斷集落刺激因子-1受體(CSF-1R)信號傳導(dǎo)，MITCHEM等[26]發(fā)現(xiàn)，抑制 CSF-1R可以減少腫瘤起始細胞的數(shù)量，增強抗腫瘤免疫，提高化療的療效。Daiichi Sankyo研發(fā)的小分子CSF-1R抑制劑，經(jīng)美國食品和藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準用于化療無效或復(fù)發(fā)的腱滑膜巨細胞腫瘤。但這些抗體和抑制劑都不能選擇性作用于M2型TAM。最近一項在小鼠模型中應(yīng)用M2型TAM CD163抗體的研究發(fā)現(xiàn)，該抗體在特異性清除M2型TAM的同時，還可以促進M1型TAM和T細胞的抗腫瘤活性[27]，這可能為M2型TAM的靶向清除研究提供關(guān)鍵的思路。

3.2 抑制TAM的募集

TAM的募集高度依賴多種趨化因子信號[28]，因此，使用單克隆抗體或小分子抑制劑干擾趨化因子信號是抑制TAM在腫瘤微環(huán)境中聚集的有效途徑，其中趨化因子C-C基序配體2(CCL2)的研究受到了廣泛的關(guān)注。CCL2與其受體CCR2結(jié)合信號在TAM的募集及其浸潤到腫瘤微環(huán)境中起著主要調(diào)節(jié)作用，在不同的動物實驗?zāi)Ｐ椭幸种艭CL2/CCR2信號均顯示出抗腫瘤效果，表現(xiàn)為腫瘤浸潤的T細胞和NK細胞功能得到增強[29]，這表明抑制CCL2/CCR2信號可以產(chǎn)生良好的免疫效應(yīng)，這可能成為一種有前景的TAM靶向治療方法。但Centocor Research & Development公司的CCL2抗體未能抑制腫瘤生長，原因是治療1周后，腫瘤細胞就代償性增加了CCL2的表達[30]，這意味著抑制CCL2/CCR2信號的治療方案仍需要新的探索。此外，基質(zhì)細胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α，sdf-1α)上調(diào)也能促進M2型TAM的募集[31]，所以使用sdf-1α受體拮抗劑可以抑制M2型TAM的募集。同時，sdf-1α受體拮抗劑與抗血管生成藥物有很強的協(xié)同作用，可增強抑制血管生成的作用[32]，發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。

3.3 促進TAM吞噬活性

3.3.1信號調(diào)節(jié)蛋白

前文已經(jīng)提到腫瘤細胞可過度表達一種CD47的“不要吃我”的信號分子，它與患者的不良預(yù)后相關(guān)。在髓系細胞上表達的信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal-regulatory protein α，Sirpα)[33]是一種抑制性受體，它可以識別并結(jié)合CD47，有效下調(diào)巨噬細胞的吞噬活性。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用藥物干擾CD47與Sirpα的相互作用，可恢復(fù)巨噬細胞的吞噬活性[34]，并在與化療藥物協(xié)同作用時，這種吞噬活性可進一步增強。在臨床研究中，阻斷抗吞噬途徑在總體上是耐受良好的，如抗CD47單抗與抗CD20單抗[35]聯(lián)合應(yīng)用在淋巴瘤患者中便取得了不錯的結(jié)果。但值得注意的是，CD47同時也在正常細胞中表達，這可能會隔離治療性的抗CD47抗體從而降低治療效應(yīng)。

3.3.2Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的激活

TLR作為天然免疫模式識別受體，主要負責病原體相關(guān)分子的識別。位于細胞表面的TLR可識別多種細菌代謝產(chǎn)物，如脂多糖和鞭毛蛋白，而細胞內(nèi)部的TLR通常接收致病核酸的刺激，激活的TLR將巨噬細胞極化為M1表型以發(fā)揮免疫效應(yīng)[36]。因此，TLR激動劑已被開發(fā)用于癌癥治療，并在臨床前研究中觀察到了對腫瘤進展的抑制作用[37]。目前咪喹莫特(imiquimod，一種TLR7激動劑)已被美國FDA批準用于鱗狀細胞癌和基底細胞癌的局部治療[38]。在HNSCC中，TLR9激動劑和PD-1抗體的聯(lián)合應(yīng)用可參與抑制腫瘤生長[39]。但由于全身應(yīng)用TLR激動劑存在一定化學(xué)毒性，以往的研究中多在可觸及的皮損處局部或瘤內(nèi)給藥，以達到良好的療效與毒性平衡。近年來的研究已經(jīng)開始使用裝載了TLR激動劑或腫瘤多肽的納米顆粒來作為新的治療方式，這不僅能夠特異性識別M2型TAM的標志物配體實現(xiàn)藥物靶向遞送，還能增強腫瘤免疫效應(yīng)[40]，因而開發(fā)這種納米藥物對腫瘤免疫治療領(lǐng)域有望實現(xiàn)新的突破。

3.4 TAM的重編程

巨噬細胞具有高度可塑性，通過對M2型巨噬細胞表面特異受體進行重編程,可促使TAM向M1型極化[41]。前文已經(jīng)提到，巨噬細胞表面的天然免疫模式識別受體TLR激活可以使巨噬細胞極化為M1表型，且已有多種TLR激動劑被開發(fā)用于癌癥治療，如抗癌藥物紫杉醇便可以通過TLR4依賴的方式將TAM重新極化為M1型[42]。此外，激活的腫瘤壞死因子家族成員CD40也可以將巨噬細胞極化為促炎表型[43]。目前聯(lián)合CD40抗體R07009879和免疫療法治療轉(zhuǎn)移性實體腫瘤的臨床研究正在進行中[34]。同時，主要在髓系細胞中表達的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3-K)和信號傳遞與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)蛋白家族可通過信號級聯(lián)反應(yīng)抑制腫瘤免疫。在小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，抑制PI3-K和STAT3的表達可以促進TAM中促炎基因的表達并抑制腫瘤的進展[44]。

腫瘤組織代謝的改變對巨噬細胞極化也有重要作用。例如，低氧條件下的腫瘤細胞和脂肪酸氧化分泌的產(chǎn)物乳酸可促進巨噬細胞M2型極化而對腫瘤細胞產(chǎn)生支持作用[45]。腺苷、谷氨酰胺和乳酸等腫瘤衍生代謝物的靶向性已經(jīng)在臨床前模型中被研究，如阻斷小鼠乳腺癌模型中谷氨酰胺的代謝或應(yīng)用谷氨酰胺合成酶抑制劑，可以促進TAM重編程為M1型，從而達到抑制腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用[46]。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明TAM的重編程可能對增強機體腫瘤免疫有積極影響。

3.5 嵌合抗原受體巨噬細胞(chimeric antigen receptor macrophages，CAR-M)

嵌合抗原受體是將腫瘤相關(guān)抗原的胞外結(jié)合區(qū)與胞內(nèi)免疫受體酪氨酸活化基序，通過胞外鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)連接嵌合形成的，它可以發(fā)揮對靶抗原的定向作用，是多種腫瘤靶向治療的技術(shù)基礎(chǔ)。以往的臨床治療中，嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)在血液系統(tǒng)腫瘤治療方面呈現(xiàn)出良好的效果[47]，但在實體腫瘤治療中仍存在極大限制，主要是由于實體腫瘤微環(huán)境中多種免疫抑制因子可以阻止免疫細胞向病灶運輸并降低T細胞對腫瘤的浸潤[48]。KLICHINSKY等[49]在對小鼠模型中的巨噬細胞進行基因改造后表達的CAR-M可以殺死腫瘤細胞，這有望成為治療實體腫瘤的有效細胞療法，從而彌補CAR-T療法的局限性。CAR-M既可以靶向吞噬腫瘤細胞，又能改變腫瘤微環(huán)境而轉(zhuǎn)變TAM的極化方向，同時還能夠?qū)⒛[瘤抗原呈遞給T細胞，激活T細胞的免疫效應(yīng)。CAR-M療法的深入研究可能為包括HNSCC在內(nèi)的實體腫瘤提供更為有效的靶向治療方案。

4 小結(jié)與展望

TAM在腫瘤免疫治療中起著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)的臨床前研究和初步臨床研究表明，多種針對TAM的治療方法正在揭示包括HNSCC在內(nèi)的惡性腫瘤的機制及免疫治療途徑，但實現(xiàn)TAM靶向治療的研究仍存在不小的挑戰(zhàn)，比如：如何改進腫瘤微環(huán)境中TAM的藥物傳遞，如何在安全條件下實現(xiàn)TAM最佳和最持久的重編程，如何識別更具特異性的靶向TAM受體，這些現(xiàn)實的問題仍需要深入的基礎(chǔ)研究。