葛志標(biāo) 管 燕 廖明亮

羊肚菌栽培具有高投入、高風(fēng)險、高效益特點，其菌種必須含有兩種交配型基因才能出菇。采用普通的羊肚菌菌種分離技術(shù)， 可能造成菌種缺失交配型基因， 需要專業(yè)科研院所通過PCR 技術(shù)進(jìn)行菌種檢測篩選， 由此導(dǎo)致羊肚菌菌種市場價高并趨于壟斷。

為了解決普通食用菌種植戶自制羊肚菌母種， 擴繁后生產(chǎn)出的羊肚菌栽培種因交配型基因缺失而造成大田生產(chǎn)不出菇的問題， 貴州市遵義縣中信食用菌專業(yè)合作社組織課題組自制母種后，利用冷庫進(jìn)行菌種出菇試驗，篩選出菌種用于大面積大田栽培，3 年平均畝產(chǎn)150 kg以上，與科研院所采用PCR 技術(shù)生產(chǎn)的菌種大田栽培產(chǎn)量相當(dāng)，具有實用推廣價值。以下是這一實踐經(jīng)驗的操作流程總結(jié)，供參考。

1 母種分離

1.1 多孢子分離 選大田栽培中個大、形好、肉厚的羊肚菌頭茬菇，用于菌種分離。 分離步驟如下：

用市售標(biāo)準(zhǔn) PDA 培養(yǎng)基 40.1 g， 加水1 000 mL 煮沸，分裝入試管和100 mL 組培瓶、錐形瓶中， 高壓滅菌鍋121 ℃保持30 分鐘，試管擺成斜面，組培瓶內(nèi)置100 mL 培養(yǎng)基，冷卻后備用。

準(zhǔn)備回形針、刀片、鑷子、吹風(fēng)機、羊肚菌子實體等。 在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行如下無菌操作：

用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹羊肚菌菌蓋表面， 達(dá)到干凈的效果，用刀片把菌蓋表面切成1 cm 見方的小塊；用酒精給回形針消毒，制成“Z”字形掛鉤，用一頭鉤住小塊羊肚菌菌蓋， 另一頭掛在組培瓶或錐形瓶上，塞緊棉塞。

放置20 ℃恒溫箱內(nèi)12～24 小時后，取出組培瓶或錐形瓶， 在超凈工作臺內(nèi)將掛鉤連同組織塊取出， 繼續(xù)塞緊棉塞，20 ℃下培養(yǎng)，2～5 天即可見到彈射出的孢子萌發(fā)出的小菌落。

仔細(xì)觀察辨認(rèn)菌落， 挑取少量菌絲轉(zhuǎn)入試管中，編號標(biāo)記。 待5 天左右長滿試管后，用體視鏡或顯微鏡檢測，選出9 支純菌種編號標(biāo)記，按編號標(biāo)記一一對應(yīng)進(jìn)行擴繁備用，9 個編號標(biāo)記的母種各用1 支接種原種， 剩余保存至出菇試驗后確定淘汰或繼續(xù)擴繁。

1.2 組織分離 PDA 培養(yǎng)基，采用柄蓋交接處組織分離獲得純菌種，每支試管進(jìn)行編號標(biāo)記。分離步驟如下：

用市售標(biāo)準(zhǔn)PDA 培養(yǎng)基40.1 g， 加1 000 mL水煮沸， 分裝入試管中， 高溫滅菌鍋121 ℃下保持30 分鐘，試管擺成斜面，冷卻后備用。

準(zhǔn)備刀片、鑷子、吹風(fēng)機、酒精燈、羊肚菌子實體等。 在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行如下無菌操作：

先用75%酒精擦拭雙手， 再用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹羊肚菌菌蓋表面，達(dá)到干凈的效果，用75%酒精棉球擦拭羊肚菌表面， 器械用酒精燈火焰滅菌冷卻后，縱向切開羊肚菌子實體，挑取柄蓋交接處組織，置入斜面培養(yǎng)基試管中，編號標(biāo)記。

放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～5 天菌絲萌發(fā)，挑取菌絲轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，按編號標(biāo)記，5 天左右長滿試管，選擇9 支進(jìn)行編號擴繁標(biāo)記，將9 個編號標(biāo)記的母種各用1 支接種原種， 剩余保存至出菇試驗后確定淘汰或繼續(xù)擴繁。

2 原種制作

1）制作培養(yǎng)基。 按照木屑68%、麥粒22%、土壤7%、 石灰2%、 石膏1%的比例配制培養(yǎng)基。步驟如下：稱取麥粒，加石灰浸泡24 小時或煮沸后保持30 分鐘左右，以麥粒吸水飽滿且麥皮不開裂為度，加木屑（0.5 cm）、土壤、石膏等混勻裝瓶，高壓或常壓滅菌，冷卻后接種培養(yǎng)。

2）接種培養(yǎng)。 用多孢分離或組織分離后編號標(biāo)記的9 支斜面母種， 每支接種1 瓶原種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，按母種編號標(biāo)記，共9 瓶。 10 天左右長滿菌種瓶。

3 栽培種制作

1）制作培養(yǎng)基。 按照木屑45%、麥粒45%、土壤7%、 石灰2%、 石膏1%的比例配制培養(yǎng)基。步驟如下：稱取麥粒，加石灰浸泡24 小時或煮沸后保持30 分鐘左右，以麥粒吸水飽滿且麥皮不開裂為度，加木屑（0.5 cm）、土壤、石膏等混勻裝袋，高壓或常壓滅菌，冷卻后接種培養(yǎng)。

2）接種培養(yǎng)。 將 9 瓶編號標(biāo)記的原種，1 瓶接種1 個栽培袋，按原種編號標(biāo)記，共9 袋。 15天左右長滿菌種袋。

4 營養(yǎng)袋制作

準(zhǔn)備12 cm×24 cm 聚丙烯袋，玉米芯100 g，麥粒150 g，石膏2 g，石灰2 g。將麥粒用石灰水浸泡12～24 小時；玉米芯加水，24 小時翻1 次，悶48 小時后與石灰、石膏、浸泡的麥?；靹?，裝入聚丙烯袋，高溫高壓滅菌8 小時，冷卻備用。每袋營養(yǎng)袋濕重350 g 左右。

5 篩選菌種

通過冷庫出菇試驗篩選菌種。

5.1 試驗過程

1）準(zhǔn)備長方形或正方形容器，保證底部能夠瀝水。

2）選取壤土，用石灰混勻消毒，根據(jù)土壤干濕度進(jìn)行水分調(diào)節(jié)，至土壤手握成團(tuán)，自由落下能散開為宜。

3）容器底部及四周用地膜鋪蓋。 地膜要超出容器至完全覆蓋上部， 地膜上橫豎20 cm 均勻打孔通水通氣， 然后裝入消毒處理后的土壤至容器4/5 處。

4）撒播栽培種。 播種后覆蓋2 cm 厚的土壤，栽培容器按栽培種編號標(biāo)記，共9 個處理，每個處理重復(fù)3 次。 以科研院所的菌種作對照（1 個）。 共 28 個處理。

5）調(diào)控出菇環(huán)境。 將播種后的容器放置在可調(diào)溫冷庫中，調(diào)節(jié)溫度上限為19 ℃，溫度下限為 10 ℃，溫差 9 ℃。

6）日常管理。 播種5 天左右，菌絲長滿土面，放置營養(yǎng)袋。 把覆蓋打孔的黑地膜蓋在營養(yǎng)袋上，保溫保濕。 每周檢查1 次土壤濕度，土壤含水量保持在50%～60%。 營養(yǎng)袋放置30 天左右后，噴出菇水，開啟燈光，土面菌霜消退，原基開始分化。

5.2 試驗結(jié)果與應(yīng)用 16 個處理出現(xiàn)原基，其中包括對照（1 個），試驗和對照出現(xiàn)原基的密度基本相當(dāng)；其余12 個處理無原基，淘汰。

選擇出現(xiàn)原基的5 支栽培種試管進(jìn)行擴繁，生產(chǎn)菌種，用于大田栽培。

6 應(yīng)注意的問題

1）配方中的原材料要新鮮，玉米芯、麥粒、木屑等處理要到位。

2）母種轉(zhuǎn)管時要橫向截取菌塊，不要縱向截取。

3）培養(yǎng)溫度一定不要超過22 ℃，菌種用冷藏車運輸，保證低溫環(huán)境。

4）菌種一定要放置在通風(fēng)、涼爽的地方儲存，不能堆碼。

5）控制轉(zhuǎn)管次數(shù)，不要超過5 代。