彭子樂(lè)，王良韜，吳永貴,3,4,5,*，伍建業(yè)

1. 貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，喀斯特地質(zhì)資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025 2. 浙江省嘉興市南湖生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，嘉興 314001 3. 貴州喀斯特環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)教育部野外科學(xué)觀測(cè)研究站，貴陽(yáng) 550025 4. 貴州省劣境生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550025 5. 貴州大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所，貴陽(yáng) 550025

一直以來(lái)，學(xué)術(shù)界均認(rèn)為富營(yíng)養(yǎng)化通常是由于河塘湖泊等水體接納了過(guò)多氮（N）、磷（P）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使初級(jí)生產(chǎn)力水平大幅增加，導(dǎo)致藻類(lèi)等浮游植物大量繁殖，葉綠素a含量增加，水體透明度和溶解氧降低[1]從而導(dǎo)致的水質(zhì)及水生態(tài)惡化。但在日益加劇的人類(lèi)活動(dòng)影響下，工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)以及生活污水的大量排放，除了使N、P等營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)入水體，也使大量重金屬在水體中不斷積累，從而加快了河湖塘庫(kù)水體的富營(yíng)養(yǎng)化演變速度。尤其是工礦行業(yè)排放的廢水中往往富含有各類(lèi)重金屬（如Cu、Zn、Cd和Pb等）[2]，經(jīng)在多介質(zhì)多界面環(huán)境中進(jìn)行傳輸后進(jìn)入自然水體。而作為水體重要污染內(nèi)源的富含N、P和重金屬的沉積物，在一定的條件下也會(huì)向水體持續(xù)釋放N、P等營(yíng)養(yǎng)元素以及重金屬等污染物[3-5]，由此形成外源和內(nèi)源的復(fù)合污染，導(dǎo)致水環(huán)境及水生態(tài)的日益惡化[6-7]。因此，水體富營(yíng)養(yǎng)化以及重金屬污染已成為當(dāng)前全球水生態(tài)系統(tǒng)的2個(gè)主要問(wèn)題[8]。但在受重金屬及較高濃度N、P復(fù)合污染的水體中，重金屬對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程中不同關(guān)鍵食物鏈環(huán)節(jié)的影響至今未明。

在富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理和修復(fù)中，生態(tài)修復(fù)可通過(guò)恢復(fù)和重建水生生態(tài)系統(tǒng)來(lái)調(diào)整河塘湖泊水體的穩(wěn)定性[9]。正常的水生態(tài)系統(tǒng)需要完整的生物鏈，作為聯(lián)系初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）和次級(jí)消費(fèi)者（魚(yú)類(lèi)）的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)的初級(jí)消費(fèi)者（浮游動(dòng)物），浮游動(dòng)物對(duì)毒害物質(zhì)（如重金屬）極其敏感且易中毒死亡，由此導(dǎo)致水生食物鏈中斷。銅作為環(huán)境中使用較為廣泛的重金屬之一，是生物機(jī)體細(xì)胞代謝的重要元素，但過(guò)量的銅會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生不同程度的毒性[10-12]，且易積累在水生生物體內(nèi)，通過(guò)水生食物鏈進(jìn)入人體[13]，最終危害人體健康[14]，所以銅成為潛在風(fēng)險(xiǎn)最大的重金屬元素之一[15-17]。為了探究在受重金屬及高濃度N、P復(fù)合污染的水體中，重金屬在富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程中對(duì)水體關(guān)鍵食物鏈環(huán)節(jié)的變化中所起的作用，本研究選取Cu2+為重金屬的代表，通過(guò)構(gòu)建受重金屬及高濃度N、P復(fù)合污染的水體中生產(chǎn)者（斜生柵藻Scenedesmusobliquus）-初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞Daphniacarinata）-次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)Daniorerio）的微宇宙實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行單向多級(jí)圍隔試驗(yàn)，記錄和分析試驗(yàn)開(kāi)始第1、3、5、7、9和11天時(shí)不同試驗(yàn)階段體系內(nèi)不同圍隔區(qū)域中斜生柵藻藻密度與葉綠素a含量、水體CODCr值與濁度、隆線溞與斑馬魚(yú)的存活、攝食活動(dòng)及死亡率等的變化規(guī)律，研究了不同濃度Cu2+在高濃度N、P條件下對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程中系統(tǒng)內(nèi)“斜生柵藻—隆線溞—斑馬魚(yú)”3個(gè)不同等級(jí)食物鏈環(huán)節(jié)生物效應(yīng)的影響，相關(guān)研究結(jié)果可為水生生態(tài)系統(tǒng)的重金屬污染和水體富營(yíng)養(yǎng)化的科學(xué)治理及環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品及試劑

CuSO4·5H2O、HgSO4、K2Cr2O7、Ag2SO4、H2SO4（ρ=1.84 g·mL-1）、H6N2O4S、C6H12N4和95%乙醇，均分析純。

H2SO4-Ag2SO4試劑：取10 g Ag2SO4，加入到1 000 mL H2SO4（ρ=1.84 g·mL-1）中，靜置1～2 d，攪拌，使其溶解。0.1225 g·mL-1K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)溶液：將6.1250 g在105 ℃干燥120 min的K2Cr2O7溶解于去離子水中，定容至500 mL。H6N2O4S溶液：稱(chēng)取1.000 g H6N2O4S溶于水中，定容至100 mL。C6H12N4溶液：稱(chēng)取10.000 g C6H12N4溶于水中，定容至100 mL。濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取5.00 mL H6N2O4S溶液與5.00 mL C6H12N4溶液于100 mL容量瓶中；置于（25±3） ℃靜置反應(yīng)24 h，冷卻后稀釋至標(biāo)線，混勻，此溶液濁度為400 NTU。

1.1.2 生物培養(yǎng)用水

斜生柵藻培養(yǎng)用水采用水生4號(hào)培養(yǎng)基[18]。隆線溞培養(yǎng)用水為用氣泵充分曝氣48 h以上的脫氯自來(lái)水，DO≥8 mg·L-1，氯化物30～32 mg·L-1，以CaCO3計(jì)的總硬度和總堿度分別為328.1～339.6 mg·L-1和83.28～85.19 mg·L-1，主要水質(zhì)參數(shù)為：水溫23～25 ℃，電導(dǎo)率716～721 μS·cm-1，pH 7.62～7.87。斑馬魚(yú)的培養(yǎng)用水同隆線溞培養(yǎng)用水。

1.1.3 試驗(yàn)用水

CNH3-Nm=CNH3-Nt×fNH3-Nm

（1）

fNH3-Nm=100/[1+antilog（pKa-pH）]

（2）

式中：fNH3-Nm為NH3-Nm在NH3-Nt中所占百分比，Ka為NH4+的電離常數(shù)，pKa=-logKa。

基于水生4號(hào)培養(yǎng)基中NH4+對(duì)隆線溞及斑馬魚(yú)的生物毒性[19]，將（NH4）2SO4替換為相同氮濃度的NaNO3。在以改進(jìn)的水生4號(hào)培養(yǎng)基為試驗(yàn)用水的體系中，TP含量為1.04 mg·L-1，TN含量為42.38 mg·L-1，按照目前的富營(yíng)養(yǎng)化分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)為重度富營(yíng)養(yǎng)化條件。改進(jìn)的水生4號(hào)培養(yǎng)基成分（1 000 mL）如表1所示。

1.1.4 試驗(yàn)生物及其培養(yǎng)

斜生柵藻的培養(yǎng)：斜生柵藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方法參見(jiàn)國(guó)標(biāo)（GB/T 13266—1991）附錄B[18]。斜生柵藻的培養(yǎng)條件為（21±0.5） ℃，光照周期14 h·d-1，光照強(qiáng)度為4 000 lx。

表1 改進(jìn)的水生4號(hào)培養(yǎng)基成分Table 1 Composition of improved aquatic No.4 medium

隆線溞的培養(yǎng)：隆線溞經(jīng)多代孤雌生殖，分離、純化和篩選的單克隆純生物株Dc42在試驗(yàn)室經(jīng)多代培養(yǎng)后，在試驗(yàn)前20～25 d用橡膠頭玻璃吸管吸取齡期一致的幼溞在溫度（21±0.5） ℃、光照周期14 h·d-1、光強(qiáng)1 800 lx的環(huán)境下純培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，每周用強(qiáng)制曝氣48 h以上的自來(lái)水換水2次，每次換掉培養(yǎng)容器中水量的1/3，每日需定時(shí)投喂新鮮斜生柵藻濃縮液，濃度為1.5×105～2.0×105個(gè)·mL-1[20]。

斑馬魚(yú)的培養(yǎng)：斑馬魚(yú)體質(zhì)量（0.28±0.10） g，平均體質(zhì)量0.22 g。試驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng)14 d以上，飼養(yǎng)期間自然死亡率<0.5%，試驗(yàn)前1 d停止喂食，試驗(yàn)期間不喂食。

1.1.5 單向多級(jí)圍隔構(gòu)建的微宇宙實(shí)驗(yàn)體系試驗(yàn)裝置

單向多級(jí)圍隔構(gòu)建的微宇宙實(shí)驗(yàn)體系試驗(yàn)裝置如圖1所示[21]。該實(shí)驗(yàn)裝置由3部分構(gòu)成：最內(nèi)層圍隔是由孔徑為30目的工業(yè)濾布縫制的圓柱形圍隔裝置，直徑為10 cm；中間層圍隔是由孔徑為200目的工業(yè)濾布制作，直徑為14 cm；最外層是直徑為18 cm的圓柱形玻璃缸。由工業(yè)濾布縫制的圍隔底部都用相應(yīng)的濾布密封，骨架采用市售PVC扁平包扎帶制作。

所構(gòu)建的單向多級(jí)圍隔微宇宙試驗(yàn)系統(tǒng)中，外層的生產(chǎn)者（斜生柵藻）可充分?jǐn)z取體系內(nèi)水體中的N、P營(yíng)養(yǎng)并有充分的光照和生長(zhǎng)發(fā)育繁殖空間，且能自如通過(guò)中層和內(nèi)層的均勻擴(kuò)散至整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系；中間層的初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）實(shí)驗(yàn)區(qū)中，隆線溞可在該區(qū)域自由攝取體系內(nèi)的斜生柵藻，并擁有適合的光照和生長(zhǎng)發(fā)育繁殖空間，且能自如通過(guò)內(nèi)層的圍隔均勻擴(kuò)散至除外層斜生柵藻實(shí)驗(yàn)區(qū)的中層和內(nèi)層水體中；而最內(nèi)層的次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)）實(shí)驗(yàn)區(qū)中，斑馬魚(yú)可在該區(qū)域自由攝取體系內(nèi)經(jīng)中層圍隔自由出入的隆線溞，并擁有適合的光照和生長(zhǎng)發(fā)育繁殖空間，但不能通過(guò)內(nèi)層的圍隔進(jìn)入中層的隆線溞實(shí)驗(yàn)區(qū)及最外層的斜生柵藻實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)系統(tǒng)中，斜生柵藻可自由通過(guò)所有體系內(nèi)圍隔均勻擴(kuò)散或分布于整個(gè)實(shí)驗(yàn)水體中，而隆線溞僅可進(jìn)入下一級(jí)食物鏈（斑馬魚(yú)）區(qū)域，斑馬魚(yú)則僅限于其所在的區(qū)域。參考自然廣域水體中各食物鏈環(huán)節(jié)間空間間距相對(duì)較大、個(gè)體之間也較為分散的實(shí)際，按生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量傳遞方向和規(guī)律設(shè)計(jì)的該單向多級(jí)圍隔微宇宙試驗(yàn)系統(tǒng)，可有效避免在小容積試驗(yàn)體系下，各休戚相關(guān)的食物鏈環(huán)節(jié)因顯得過(guò)于“親密接觸”導(dǎo)致在較小容積的體系內(nèi)，行動(dòng)敏捷的次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)）對(duì)行動(dòng)遲緩的初級(jí)消費(fèi)者（浮游動(dòng)物隆線溞）產(chǎn)生的快速捕食（同理，初級(jí)消費(fèi)者的隆線溞對(duì)初級(jí)生產(chǎn)者藻類(lèi)的快速濾食）造成試驗(yàn)系統(tǒng)中初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）或初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）等食物鏈關(guān)鍵環(huán)節(jié)的快速消失，從而保障實(shí)驗(yàn)體系的有序開(kāi)展。

圖1 單向多級(jí)圍隔構(gòu)建的微宇宙實(shí)驗(yàn)體系試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of microcosmic experimental system test device constructed by unidirectional multistage enclosure

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單向多級(jí)圍隔微宇宙試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)主要研究在單向多級(jí)圍隔試驗(yàn)條件下，在高N、P條件和重金屬Cu2+復(fù)合作用下，對(duì)由斜生柵藻—隆線溞—斑馬魚(yú)三級(jí)食物鏈構(gòu)成的水生態(tài)系統(tǒng)的影響。依據(jù)Cu2+對(duì)斜生柵藻、隆線溞、斑馬魚(yú)以及三者共存條件下的毒性試驗(yàn)結(jié)果[21]，試驗(yàn)設(shè)置3組不同濃度處理組和1組空白組，濃度依次為0、0.01、0.04和0.16 mg·L-1，試驗(yàn)設(shè)置的Cu2+濃度范圍在斑馬魚(yú)的耐受范圍內(nèi)[22]，但遠(yuǎn)超過(guò)隆線溞的耐受范圍[19]；藻、溞、魚(yú)3組試驗(yàn)組放置圍隔裝置后，放入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻，起始藻密度為5×104個(gè)·mL-1[20]，斜生柵藻能夠自由通過(guò)體系內(nèi)所有圍隔孔徑，到達(dá)在整個(gè)體系內(nèi)各試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)生長(zhǎng)；對(duì)于溞、魚(yú)2個(gè)試驗(yàn)組，把約300只隆線溞放入用200目濾布制成的圍隔內(nèi)，隆線溞能夠在由其形成的空間內(nèi)自由活動(dòng)并有可自由出入內(nèi)層圍隔進(jìn)入斑馬魚(yú)試驗(yàn)區(qū)；而對(duì)于魚(yú)試驗(yàn)組，在最內(nèi)層30目的圍隔內(nèi)放入1條斑馬魚(yú)。試驗(yàn)共進(jìn)行11 d，取樣時(shí)間分別為第1、3、5、7、9和11天。

1.2.2 試驗(yàn)指標(biāo)觀測(cè)

本試驗(yàn)觀測(cè)以下指標(biāo)：分別為水樣CODCr、濁度、藻密度（O484）、葉綠素a（Chla）；隆線溞與斑馬魚(yú)的存活、攝食活動(dòng)及死亡率。CODCr測(cè)定參照唐紅梅[23]的方法。濁度測(cè)量采用分光光度法[24]。藻密度（O484）在484 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。葉綠素a（Chla）采用熱乙醇法測(cè)定[25-26]。

隆線溞的存活、攝食活動(dòng)及死亡率：隆線溞的死亡以“沉入水底，輕轉(zhuǎn)容器無(wú)任何反應(yīng)”為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)開(kāi)始后，觀察并記錄在第1、3、5、7、9和11天隆線溞的攝食活動(dòng)及死亡數(shù)量，得出死亡率，試驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)剔除死亡個(gè)體。

斑馬魚(yú)的存活、攝食活動(dòng)及死亡率：斑馬魚(yú)的死亡以“鰓蓋停止活動(dòng)，對(duì)外界刺激無(wú)任何反應(yīng)，喪失游泳能力且沉入水底”為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)開(kāi)始后，觀察并記錄在第1、3、5、7、9和11天斑馬魚(yú)的攝食活動(dòng)及存活情況，得出死亡率，并及時(shí)清理死魚(yú)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理與分析

為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性，采用狄克遜（Dixon）檢驗(yàn)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。處理間平均數(shù)差異顯著性的多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法，并采用OriginPro 2018繪制相關(guān)曲線圖。

2 結(jié)果（Results）

2.1 不同濃度Cu2+在高N、P條件下對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)中藻密度的影響

如圖2所示，空白組斜生柵藻藻密度在0～5 d內(nèi)基本保持穩(wěn)定，至第3天僅有極小幅度的下降，隨著時(shí)間的推移，在5～9 d和11 d內(nèi)藻密度開(kāi)始有一定幅度的上升，此后至試驗(yàn)結(jié)束，藻密度基本保持不變，此條件下體系內(nèi)水體藻密度的吸光度（O484）為0.036。較低濃度（0.01 mg·L-1）的Cu2+試驗(yàn)組藻密度變化規(guī)律和空白組的變化規(guī)律相似，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，藻密度的吸光度（O484）為0.041，且空白試驗(yàn)組和低濃度（0.01 mg·L-1）Cu2+試驗(yàn)組初級(jí)消費(fèi)者的隆線溞與次級(jí)消費(fèi)者的斑馬魚(yú)都未受到明顯影響（隆線溞死亡率為0%、斑馬魚(yú)死亡率為0%）。特別值得注意的是，一定濃度（0.04 mg·L-1）的Cu2+存在條件下，試驗(yàn)組斜生柵藻的生長(zhǎng)速度及藻密度與0、0.01和0.16 mg·L-1Cu2+濃度組相比呈快速增加趨勢(shì)，且隆線溞開(kāi)始陸續(xù)死亡（死亡率高達(dá)80%），但斑馬魚(yú)的存活率未受明顯影響（死亡率為0%），在5～11 d的整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)藻密度持續(xù)快速上升，水體顏色逐漸變得濃綠，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)0.04 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組的藻密度（O484）的吸光度高達(dá)0.125。

圖2 高濃度N、P條件下不同濃度Cu2+的存在對(duì)系統(tǒng)中斜生柵藻藻密度的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of Cu2+ on the density of Scenedesmus obliquus in the system under high concentrations of N and P

較高濃度（0.16 mg·L-1）的Cu2+試驗(yàn)組在0～5 d藻密度略有波動(dòng)且呈現(xiàn)體系水體顏色有變深的現(xiàn)象，但在此濃度下的斜生柵藻在5 d及后期均受到較高濃度Cu2+的毒害，表現(xiàn)為從第5天至第7天藻密度有小幅上升，但至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻密度的吸光度（O484）開(kāi)始降低，藻密度的吸光度（O484）為0.035，并且在該濃度下隆線溞全部死亡（死亡率達(dá)100%），斑馬魚(yú)尚未受到明顯毒害，死亡率為0%。

2.2 不同濃度Cu2+在高N、P條件下對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)葉綠素a的影響

不同濃度Cu2+在高N、P條件下對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)葉綠素a的影響與對(duì)斜生柵藻藻密度的變化具有相似的趨勢(shì)（圖3），空白組體系中包括斜生柵藻、隆線溞及斑馬魚(yú)等各級(jí)食物鏈環(huán)節(jié)的數(shù)量和存活情況相對(duì)較為穩(wěn)定和正常，其中，葉綠素a在1～7 d有小幅上升，隨后至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)均保持穩(wěn)定，此時(shí)葉綠素a含量為173.6 μg·L-1，隆線溞死亡率為0%，斑馬魚(yú)死亡率為0%。較低濃度（0.01 mg·L-1）的Cu2+試驗(yàn)組葉綠素a在1～3 d內(nèi)變化不大，在3～11 d逐漸上升，且對(duì)體系中的隆線溞及斑馬魚(yú)未產(chǎn)生明顯的毒性作用，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，葉綠素a含量為395.25 μg·L-1，隆線溞死亡率為0%，斑馬魚(yú)死亡率為0%。

同0.04 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組顯著促進(jìn)藻密度增加的趨勢(shì)一樣，該濃度的Cu2+存在條件下體系中葉綠素a含量在1～5 d內(nèi)有一定幅度的增加，在5～11 d葉綠素a含量迅速上升，但體系中的隆線溞此時(shí)已表現(xiàn)出明顯的中毒死亡現(xiàn)象，因此，此濃度條件下體系中藻密度及葉綠素a含量同步激增，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體系內(nèi)葉綠素a含量高達(dá)874.7 μg·L-1，隆線溞死亡率為80%，斑馬魚(yú)死亡率為0%。同前述較高濃度（0.16 mg·L-1）Cu2+試驗(yàn)組對(duì)體系藻密度變化的影響規(guī)律相似，葉綠素a在1～5 d內(nèi)基本保持穩(wěn)定且總體上葉綠素a含量較低；在5～7 d葉綠素a有一定幅度上升，7～11 d有小幅上升；至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體系葉綠素a含量為378.04 μg·L-1，隆線溞在試驗(yàn)開(kāi)始不久后24 h內(nèi)死亡率達(dá)100%，斑馬魚(yú)死亡率為0%。

2.3 不同濃度Cu2+在高N、P條件下對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)CODCr的影響

如圖4所示，空白組CODCr在1～5 d內(nèi)有小幅度的下降，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，CODCr逐漸上升，至11 d的試驗(yàn)結(jié)束時(shí)CODCr值為20.5 mg·L-1，僅比試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)略有增加，在此期間，作為初級(jí)消費(fèi)者的隆線溞和次級(jí)消費(fèi)者的斑馬魚(yú)存活狀況良好，隆線溞和斑馬魚(yú)的死亡率均為0%，水質(zhì)、水色等也較為穩(wěn)定。0.01 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組對(duì)水體CODCr變化的影響總體也不明顯，在1～3 d內(nèi)水體CODCr呈下降趨勢(shì)，幅度較小；在3～11 d水體CODCr緩慢上升，至11 d的試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體的CODCr值為22.7 mg·L-1。

圖3 高N、P條件下不同濃度Cu2+的存在對(duì)系統(tǒng)內(nèi)斜生柵藻葉綠素a的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of Cu2+on chlorophyll a changes in Scenedesmusobliquus under high N and P conditions

圖4 高N、P條件下不同濃度Cu2+對(duì)體系中水體CODCr變化的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of Cu2+ on CODCr changes in water body under high N and P conditions

0.04mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組CODCr在1～5 d內(nèi)小幅上升且在5～7 d內(nèi)基本保持穩(wěn)定，隨著試驗(yàn)進(jìn)行至第9天時(shí)CODCr有較大幅度上升，試驗(yàn)結(jié)束的11 d時(shí)CODCr值已高達(dá)75 mg·L-1（此濃度條件下隆線溞死亡率為80%，斑馬魚(yú)死亡率為0%）。而更高濃度（0.16 mg·L-1）的Cu2+試驗(yàn)組CODCr在試驗(yàn)周期內(nèi)變化趨勢(shì)與0.01 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組較為相似，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CODCr值為39 mg·L-1，隆線溞死亡率為100%，斑馬魚(yú)死亡率為0%。

2.4 不同濃度Cu2+在高N、P條件下對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)濁度的影響

如圖5所示，空白組濁度在第1～5天內(nèi)基本保持穩(wěn)定，第5天較第3天略有上升，此后直至試驗(yàn)結(jié)束期間，空白濃度組濁度有一定幅度上升后保持穩(wěn)定，濁度為11.5 NTU。0.01 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組濁度變化趨勢(shì)、受試生物存活狀況與空白濃度組變化趨勢(shì)較為一致（濁度為13.6 NTU，隆線溞死亡率為0%，斑馬魚(yú)死亡率為0%）。而較高濃度（0.16 mg·L-1）Cu2+試驗(yàn)組濁度在11 d的實(shí)驗(yàn)期內(nèi)總體上與較低濃度（0.01 mg·L-1） Cu2+及空白組的變化規(guī)律相似，其中在1～5 d內(nèi)先上升后下降；從第5天開(kāi)始濁度逐漸上升至在第9天時(shí)濁度達(dá)到最大值，第11天時(shí)濁度較第9天略微下降（濁度為9.8 NTU），但與較低濃度（0.01 mg·L-1）Cu2+及空白組完全不同的是，較高濃度（0.16 mg·L-1）Cu2+試驗(yàn)組的隆線溞死亡率為100%。

圖5 高N、P條件下不同濃度Cu2+對(duì)系統(tǒng)內(nèi)水體濁度的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of Cu2+ on turbidity of water in the system under high N and P conditions

與0、0.01和0.16 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組濁度相比，0.04 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組濁度差異非常明顯，在試驗(yàn)周期內(nèi)，逐漸上升，最終在第11天達(dá)最大值42.5 NTU（此時(shí)隆線溞死亡率高達(dá)80%，斑馬魚(yú)死亡率為0%）。

3 討論（Discussion）

通過(guò)分析比較構(gòu)建的水生生態(tài)微宇宙實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)運(yùn)行第1、3、5、7、9和11天時(shí)不同試驗(yàn)階段體系內(nèi)藻密度（O484）與葉綠素a含量、水體CODCr值與濁度、隆線溞與斑馬魚(yú)的存活、攝食活動(dòng)及死亡率等的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同濃度Cu2+在高濃度N、P復(fù)合污染模擬高富營(yíng)養(yǎng)化的水體中，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈各環(huán)節(jié)尤其是初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）的毒性是造成水生食物鏈斷裂的關(guān)鍵性因素，繼而對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)不同的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)并由此觸發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化的爆發(fā)。試驗(yàn)設(shè)置的Cu2+濃度在斑馬魚(yú)耐受范圍內(nèi)[22]，所以在試驗(yàn)期內(nèi)，斑馬魚(yú)死亡率為0%。

空白試驗(yàn)組中，由于單向多級(jí)圍隔裝置限制隆線溞對(duì)斜生柵藻的濾食且無(wú)其他毒害物質(zhì)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻密度基本保持不變，因斜生柵藻的繁殖消耗了水中有機(jī)碳的同時(shí)，其光合放氧作用也會(huì)導(dǎo)致水體CODCr呈下降趨勢(shì)，所以即使在高濃度N、P條件下，生產(chǎn)者（斜生柵藻）在無(wú)機(jī)環(huán)境中所獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及通過(guò)光合作用所固定的能量能夠通過(guò)食物鏈傳遞到初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞），通過(guò)單向多級(jí)圍隔裝置，使斑馬魚(yú)對(duì)隆線溞的捕食受到限制，從而確保斜生柵藻—隆線溞—斑馬魚(yú)三級(jí)食物鏈的完整而沒(méi)有發(fā)生中斷，系統(tǒng)水體各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)較好。在本試驗(yàn)中，初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）對(duì)控制水生態(tài)系統(tǒng)的富營(yíng)養(yǎng)化有重要作用，表明健全的水生生態(tài)系統(tǒng)能夠消納高濃度N、P帶來(lái)的壓力而不易發(fā)生水體富營(yíng)養(yǎng)化。

在0.01 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組中，初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的急性毒性反應(yīng)（死亡率為0%）。首先，0.01 mg·L-1Cu2+小于隆線溞96 h-EC50[21]；其次，試驗(yàn)時(shí)所用300只隆線溞并不是出生僅24 h隆線溞，而是隨機(jī)撈取，個(gè)體較大，其對(duì)Cu2+敏感性較幼溞較弱；最后，斜生柵藻對(duì)重金屬有一定的吸收作用[27-28]，可降低水體中Cu2+濃度，從而降低Cu2+對(duì)隆線溞的毒性。生產(chǎn)者（斜生柵藻）也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)，相反，表現(xiàn)出一定的毒性興奮效應(yīng)[29]，0.01 mg·L-1Cu2+明顯促進(jìn)斜生柵藻的生長(zhǎng)[30]。但初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）通過(guò)濾食生產(chǎn)者（斜生柵藻），且在初期溞的攝食率速度較高[31]，即使維持體系中高濃度的N、P但仍能自行控制生產(chǎn)者（斜生柵藻）的數(shù)量處于較低水平[32]，此條件下水生生態(tài)系統(tǒng)未發(fā)生水體富營(yíng)養(yǎng)化。

在0.04 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組中，Cu2+對(duì)初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）顯示較強(qiáng)毒性而導(dǎo)致初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）數(shù)量大為減少（隆線溞死亡率達(dá)80%），未死的個(gè)體顯示活動(dòng)能力及濾食能力顯著減弱，對(duì)天敵的敏感性降低[33]，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)CODCr值已高達(dá)75 mg·L-1，推測(cè)原因與此時(shí)體系中的隆線溞大量死亡腐解有直接關(guān)系。這表明在0.04 mg·L-1Cu2+條件下，隆線溞作為關(guān)鍵性食物鏈環(huán)節(jié)，無(wú)法完成生產(chǎn)者（斜生柵藻）從水環(huán)境中吸收的N、P以及通過(guò)光合作用積累的物質(zhì)和能量的傳遞，系統(tǒng)內(nèi)“斜生柵藻—隆線溞—斑馬魚(yú)”3個(gè)不同等級(jí)食物鏈環(huán)節(jié)近乎中斷，導(dǎo)致體系內(nèi)生產(chǎn)者（斜生柵藻）因?yàn)槭ヌ鞌常【€溞），而未被濾食且在高濃度氮磷刺激下大量繁殖，物質(zhì)和能量累積在初級(jí)生產(chǎn)者這一營(yíng)養(yǎng)級(jí)，導(dǎo)致初級(jí)生產(chǎn)力很大，生產(chǎn)者數(shù)量遠(yuǎn)高于初級(jí)消費(fèi)者數(shù)量，最終顯示水生態(tài)系統(tǒng)形成生產(chǎn)者（斜生柵藻）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的重度富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象。

在0.16 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組中，體系水體顏色有變深的現(xiàn)象，估計(jì)與所加銅離子的顏色有關(guān)，在該濃度的Cu2+影響下CODCr值維持較低水平與前期隆線溞死亡速度快、打撈死溞相對(duì)較為集中和及時(shí)，且與高濃度Cu2+的殺菌滅菌作用導(dǎo)致死亡的隆線溞或部分藻類(lèi)的腐爛受到一定程度的抑制有關(guān)。生產(chǎn)者（斜生柵藻）在此濃度Cu2+下受到一定的毒害，在試驗(yàn)的1～5 d受到明顯的抑制作用（圖2），由于部分死亡藻類(lèi)顆粒導(dǎo)致0.16 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組藻密度曲線在1～5 d時(shí)是先升高后降低的外凸曲線（圖3），0.16 mg·L-1Cu2+試驗(yàn)組葉綠素a曲線在1～5 d時(shí)是內(nèi)凹曲線，表明斜生柵藻受到Cu2+的抑制，使葉綠素a呈略微下降趨勢(shì)。段晨雪等[34]的研究表明濃度高于50 μmol·L-1的Cd2+會(huì)抑制葉綠素a的合成。作為聯(lián)系初級(jí)生產(chǎn)者（斜生柵藻）和次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)）物質(zhì)和能量流動(dòng)紐帶的水生食物鏈關(guān)鍵環(huán)節(jié)的所有初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）在該濃度試驗(yàn)開(kāi)始不久后24 h內(nèi)的死亡率達(dá)100%，而此時(shí)的次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)）由于仍然具有較強(qiáng)的耐受性存活率幾乎沒(méi)有受到明顯影響，但水生食物鏈發(fā)生中斷，由此將導(dǎo)致次級(jí)消費(fèi)者（魚(yú)類(lèi)）食物（物質(zhì)和能量）的缺失而最終死亡，也將會(huì)導(dǎo)致初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）因缺乏必要的攝食者而失控泛濫，并逐漸顯現(xiàn)出水色濃綠的富營(yíng)養(yǎng)化特征。值得注意的是，在該微宇宙體系中，供試材料（硫酸銅）中的二價(jià)銅離子除了對(duì)系統(tǒng)中的藻-溞-魚(yú)各級(jí)食物鏈的代表性生物自身具有不同程度的直接毒性作用外，由于銅物種敏感度分布法（SSD）計(jì)算得到的HC5（即在銅的物種敏感度分布曲線中保護(hù)95%以上物種的濃度水平）主要針對(duì)的物種是微生物和藻類(lèi)，因此本研究所用的銅離子還可通過(guò)減少或清除水生生態(tài)系統(tǒng)中分解者（微生物）和生產(chǎn)者（藻類(lèi)）的方式改變系統(tǒng)中食物鏈的構(gòu)成，繼而影響到水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞，從而導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)的加速惡化。

綜上所述：（1）在高濃度N、P條件下無(wú)重金屬的空白試驗(yàn)組及低濃度的Cu2+試驗(yàn)組中，初級(jí)生產(chǎn)者（斜生柵藻）、初級(jí)消費(fèi)者（隆線溞）和次級(jí)消費(fèi)者（斑馬魚(yú)）總體發(fā)展較為均衡，水生食物鏈未發(fā)生斷裂，各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)良好，表明在無(wú)毒害物質(zhì)或少量毒害物質(zhì)（如重金屬）存在條件下，健全的水生生態(tài)系統(tǒng)能夠消納高濃度N、P帶來(lái)的壓力而不易發(fā)生水體富營(yíng)養(yǎng)化。（2）較高濃度的重金屬Cu2+對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程具有明顯的促進(jìn)作用。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，當(dāng)重金屬Cu2+濃度超過(guò)敏感的關(guān)鍵食物鏈環(huán)節(jié)（如初級(jí)消費(fèi)者的浮游動(dòng)物）毒性閾值時(shí)，對(duì)初級(jí)消費(fèi)者產(chǎn)生的毒害作用（隆線溞死亡率達(dá)80%）明顯大于對(duì)水生食物鏈初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）以及次級(jí)消費(fèi)者（魚(yú)類(lèi)）時(shí)，將導(dǎo)致水生食物鏈中斷，繼而造成初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）未被濾食且在高濃度N、P供給下的大量繁殖，最終形成初級(jí)生產(chǎn)者（藻類(lèi)）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的重度富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象。（3）在遭受毒害物質(zhì)（如重金屬）及高濃度N、P復(fù)合污染的水體中，毒害物質(zhì)（如重金屬）是造成體系中敏感性關(guān)鍵性食物鏈環(huán)節(jié)（如初級(jí)消費(fèi)者的浮游動(dòng)物）斷裂或消失及水生生態(tài)系統(tǒng)崩潰、繼而導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程加劇的關(guān)鍵性因素之一，需要引起足夠重視。在水環(huán)境治理或水生生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格限制包括重金屬在內(nèi)的有毒有害持久性污染物排放至自然水體中。