劉軍，李珊，張雅楠，王元鳳,2,*

1. 中國政法大學證據科學研究院，北京 100192 2. 法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192

由于工業(yè)化的迅速發(fā)展和城市人口的集中，人們生產生活所產生的污染物對環(huán)境的影響日趨嚴重。同時，隨著我國步入社會主義建設新的歷史時期，生態(tài)文明成為人民對美好生活追求的應有之義，生態(tài)環(huán)境問題也逐漸成為近年來社會關注的熱點問題。近年來，我國政府相繼頒布《環(huán)境保護法》《民法典》，建立生態(tài)環(huán)境損害賠償制度，發(fā)布《環(huán)境損害司法鑒定白皮書》，這一系列舉措使環(huán)境損害司法鑒定迎來新的發(fā)展。

環(huán)境損害司法鑒定（environmental forensics）是指在訴訟活動中鑒定人運用環(huán)境科學的技術或者專門知識，采用監(jiān)測、檢測、現場勘察、實驗模擬或者綜合分析等技術方法，對環(huán)境污染或者生態(tài)破壞訴訟涉及的專門性問題進行鑒別和判斷并提供鑒定意見的活動[1]。環(huán)境損害司法鑒定主要服務于我國環(huán)境訴訟的事實認定環(huán)節(jié)。從司法實踐來看，當事人及審判人員需要借助環(huán)境損害司法鑒定來明確污染存在與否、相關因果關系、污染程度等關鍵問題[2]。依據《司法部 生態(tài)環(huán)境部關于印發(fā)<環(huán)境損害司法鑒定執(zhí)業(yè)分類規(guī)定>的通知》，環(huán)境損害司法鑒定工作分為7類42項，其中除其他環(huán)境損害鑒定外，包括污染物性質鑒定、生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境損害鑒定在內的6類鑒定均與生態(tài)毒理學、生物毒性存在聯系[3-4]。

生物毒性（biological toxicity）是生態(tài)毒理學監(jiān)測的主要內容，根據毒性作用可分為急性、慢性和亞急（慢）性3種[5]。最高人民法院數據顯示，2020年我國環(huán)境資源類案件有23.4萬件，以水污染、大氣污染和土壤污染為主[6]。水生生物毒性試驗可以很好地服務于水污染領域的司法鑒定工作。水生生物毒性（toxicity of aquatic organism）是以水生生物作指示生物，通過受試物對水生生物的毒性效應實驗來判斷水污染物對生物體短期和長期影響程度的一種表征形式[5]。在環(huán)境損害司法鑒定中，生物毒性評價一方面可應用于刑事領域破壞環(huán)境資源保護類案件中“有毒物質”的證明；另一方面可應用于民事領域環(huán)境侵權案件以及生態(tài)環(huán)境損害鑒定評估生物調查中關鍵事實的認定。依據生態(tài)環(huán)境部2020年發(fā)布的《生態(tài)環(huán)境損害鑒定評估技術指南》（以下簡稱《技術指南》），生物調查包括生物多樣性和生物毒性的調查。在生態(tài)環(huán)境損害鑒定評估中，生物毒性評價方法主要應用于損害調查確認和因果關系分析環(huán)節(jié)，當生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性受損時，需要通過生物毒性來確定原因或排除化學物質污染引起的生物多樣性改變。同時，《技術指南》中列明的可應用于生物調查的水生生物可主要分為發(fā)光細菌、藻類、溞類、魚類和大型甲殼類等，與美國在全廢水毒性檢測（whole effluent toxicity testing, WET）中推薦的水生生物模型高度契合[7-8]?！都夹g指南》規(guī)定的水生生物毒性試驗標準方法如表1所示，不難發(fā)現，為滿足司法訴訟環(huán)節(jié)的時效要求，《技術指南》所推薦的生物調查方法大多為急性毒性或短期毒性試驗[6-7]。

水生生物毒性評價方法針對生態(tài)環(huán)境中的常見污染物、新污染物的毒性評價均有新的發(fā)展與應用。對于重金屬、消殺用品等常見水體污染物，當前研究方向集中于污染物在細胞和基因層面的毒性效應、毒性降低路徑、降解產物毒性以及其他污染物的聯合毒性等方面。Cervi等[8]以端足蟲和大型溞為受試生物，研究Cu在缺氧和亞氧淡水沉積物中的轉化和毒性，發(fā)現缺氧沉積物可引起Cu向硫化礦物近乎完全的轉化，降低了其毒性，為降低淡水中重金屬污染毒性提供了新思路。Morcillo等[9]以海洋金頭鯛為受試生物研究重金屬對水生動物在細胞層面的毒性效應，研究發(fā)現重金屬一方面可造成水生生物脂質過氧化、巰基蛋白消耗，另一方面可與核蛋白、DNA反應，對生物大分子物質造成損傷，進一步明確了重金屬污染物對生物體細胞層面的毒性效應。

表1 《生態(tài)環(huán)境損害鑒定評估技術指南 總綱和關鍵環(huán)節(jié) 第2部分：損害調查》（GB/T 39791.2—2020）中推薦的水生生物毒性試驗方法Table 1 Aquatic toxicity test methods recommended in the Technical Guidelines for the Identification and Assessment of Ecological and Environmental Damage—General and Key Links—Part 2: Damage Investigation

三氯生（triclosan, TCS）是一種合成型廣譜類抗菌劑，在生活污水中廣泛存在。楊雅淇等[10]發(fā)現依據受試生物種類不同，TCS的毒性效應差異也較大，同魚類相比，藻類對TCS更加敏感，低濃度暴露便會產生藻類生長抑制效應。朱英等[11]研究了典型家用消毒劑對水生生物的急性毒性影響及生態(tài)效應閾值，為消毒劑的毒性評價提供了方法指引。

對于抗生素等新污染物，當前研究方向集中在水生生物對新污染物的敏感性、毒性試驗方法的優(yōu)化以及抗生素間聯合毒性等方面。王作銘等[12]以4個不同營養(yǎng)級的水生生物作為代表物種對地表水中抗生素復合殘留進行毒性評價，研究發(fā)現不同模式生物對同種抗生素敏感性不同（小球藻>斑馬魚胚胎>費氏弧菌>大型溞）；不同抗生素同樣對同種模式生物的毒性亦有差異，土霉素對4種模式生物的毒性最大，其對小球藻存在極高毒性。丁婷婷等[13]以青?；【鶴67、蛋白核小球藻為受試生物研究氨基糖苷類抗生素的聯合毒性，研究發(fā)現氨基糖苷類抗生素毒性及其聯合毒性相互作用與暴露的生物、混合物的濃度、組分的濃度配比、暴露時間等有關，青海弧菌Q67對氨基糖苷類抗生素及其混合物的響應更靈敏。

1 水生生物毒性試驗的模式生物（Test models for aquatic toxicity test）

利用“中國知網”檢索2011年以來國內外相關文獻，截至2022年1月18日，以“水生生物毒性”為主題的國內外文章有2 125篇（中文887篇，外文1 238篇），以學術期刊（1 854篇）為主。在中文文獻主題及外文關鍵詞分布中，高頻次出現的涉及水生生物毒性試驗的模式生物及具體頻次如圖1所示。大量學術期刊的發(fā)表充分體現出水生生物毒性試驗在應用基礎研究方面技術成熟，在高校和科研院所實驗室平臺得到廣泛應用，已經成為常用的生態(tài)毒理學試驗方法。環(huán)境損害司法鑒定可以通過與高校及科研院所合作形式降低成本，提高效率。針對大型溞、斑馬魚等典型模式生物的大量水生生物毒性研究可以為環(huán)境損害司法鑒定提供更多科學數據支持，也可以為鑒定機構對模式生物的選擇、馴化和試驗方法優(yōu)化等方面提供借鑒。

1.1 發(fā)光細菌（Luminescent bacteria）

發(fā)光細菌類是一類在正常生理條件下能夠發(fā)射可見熒光的細菌，它常作為水生微生物毒性試驗方法的模式生物[14-15]。這種可見熒光波長分布在450～490 nm之間，在黑暗處肉眼清晰可見（圖2）。發(fā)光細菌法具有檢測迅速、反應靈敏和價格低廉等優(yōu)點[16]。發(fā)光細菌生物毒性儀的發(fā)展使得發(fā)光細菌成為水質快檢中的常用受試生物。同時，與其他基于傳統(tǒng)水生生物的檢測方法相比，發(fā)光細菌法的應用范圍更廣。除了在水體及土壤毒性檢測中得到了廣泛應用，其在氣體毒性檢測中也得到了不斷的發(fā)展[17-18]。

圖1 以“水生生物毒性”為主題的文獻中模式生物在主題及關鍵詞中出現的頻次Fig. 1 Number of occurrences of test models in keywords and themes in the literature with the theme of “aquatic toxicity”

圖2 青?；【鶴67菌落[20]注：（a）光照下青?；【鶴67菌落；（b）黑暗下青?；【鶴67菌落。Fig. 2 Vibrio qinghaiensis Q67 colonies[20]Note: （a） Vibrio qinghaiensis Q67 colony under light; （b） Vibrio qinghaiensis Q67 colony in darkness.

目前國內常用于生物毒性評價的3種發(fā)光細菌為明亮發(fā)光桿菌、費氏弧菌和青?；【?。其中，明亮發(fā)光桿菌在《水質 急性毒性的測定 發(fā)光細菌法》（GB/T 15441—1995）中得到應用；費氏弧菌在歐盟標準中以及我國國家海洋局發(fā)布的《污水生物毒性監(jiān)測技術規(guī)程 發(fā)光細菌急性毒性測試-費歇爾弧菌法》中得到應用，近年來廣泛應用于污染物聯合毒性的研究；青?；【俏覈赜械陌l(fā)光細菌，屬淡水菌，在測試飲用水源毒性時有較大優(yōu)勢，青?；【鶴67菌種還在光污染中得到應用，可用于輻射監(jiān)測與保護工作[19-20]。

作為代表性水生微生物，發(fā)光細菌在毒性檢測方面具有極高的靈敏度。除水體外，其在氣體、土壤毒性評價中均有應用。韓麗君等[17]用發(fā)光細菌法揭示SO2氣體的生物毒性，并對傳統(tǒng)曝氣條件進行了優(yōu)化。江偉等[21]針對土壤污染，建立并分析了費氏弧菌檢測土壤聯合毒性模型。此外，發(fā)光細菌法在各工業(yè)污染物毒性評價方面應用廣泛。皮革產業(yè)具有很高的環(huán)境風險，科研院所常用發(fā)光細菌法評價坯革、有機鞣劑等原料和試劑的生態(tài)毒性[22-23]。發(fā)光細菌法在能源工業(yè)污染中也有應用，如微生物燃料電池的水質生物毒性監(jiān)測，以及石油烴污染場地土壤急性毒性的微波修復評價等[24-25]。

1.2 藻類（Alga）

藻類廣泛存在于各類天然水體中，以種類繁多、個體小、繁殖迅速、對毒物毒性敏感等特點，成為了水生毒理學研究的試驗對象[26]。除此之外，藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的生產者。其所反映的生物毒性水平對生態(tài)系統(tǒng)恢復工作具有較高的參考價值，在水體生物毒性檢測中得到廣泛應用。藻類生物測試方法一直在不斷地完善和發(fā)展，1967年，美國提出暫行藻類測試程序（Provisional Algal Assay Procedure）；1981年，經濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-Operation and Development, OECD）提出了“藻類生長抑制方法”；2004年歐盟頒布了用單細胞藻進行淡水藻類生長抑制性實驗的新標準（ISO 8692:2004）；我國也于2008年發(fā)布了《化學品藻類生長抑制試驗》（GB/T 21805—2008）標準方法。

在藻類生物毒性評價中，因綠藻、硅藻和藍藻不易附著于瓶壁，具有對毒性物質響應敏感、易于實驗室培養(yǎng)的優(yōu)點，被廣泛用于毒性檢測，成為GB/T 21805—2008推薦的受試驗生物。目前，在多種藻類生物毒性試驗中，應用較為廣泛、標準較為成熟的是“藻類生長抑制試驗”方法。但該方法依賴于藻類細胞的繁殖代謝過程，測量周期長，無法滿足生物毒性快速檢測的需求。以藻類光合作用狀態(tài)為毒性測試指標的“藻類光合作用抑制試驗”則可以大幅縮短毒性檢測時間，且對污染物毒性的靈敏度也很高[27]。

就藻類而言，不同藻種對不同污染物靈敏度也存在差異。對于典型家用消毒劑，藻類的毒性高低為近頭狀偽蹄形藻>斜生柵藻>蛋白核小球藻，從物種敏感性來看，對消毒劑最敏感物種均為近頭狀偽蹄形藻。有機磷酸酯（organophosphorus compounds, OPEs）作為溴化阻燃劑的替代物，也存在一定的生態(tài)毒性，對OPEs類污染物而言，斜生柵藻靈敏度優(yōu)于蛋白核小球藻[28]。

近年來，藻類毒性試驗的技術方法得到發(fā)展。以藻類急性毒性試驗為基礎的急性毒性藻紅外測試技術在多種藥品共存的生物毒性測試分析中得到了應用與檢驗[29]，藻葉綠素熒光檢測的在線監(jiān)測優(yōu)勢也在除草劑毒性評價中得到發(fā)展。此外，藻的幼孢子體也可作為受試生物，歐澤奎等[30]以張氏馬尾藻類幼孢子體為受試生物研究海水環(huán)境中重金屬生物毒性，研究發(fā)現當Hg2+、Cd2+、Pb2+聯合作用時，Hg2+、Cd2+呈現協同效應，Hg2+、Cd2+對Pb2+產生拮抗效應。

1.3 大型溞（Daphnia magna）

大型溞是一種常見的淡水枝角類浮游動物，是溞科中體型最大、生殖量最大的一種，其在淡水生態(tài)系統(tǒng)分布廣泛，且取材方便、易于培養(yǎng)，是研究水生生物學和環(huán)境毒理學的良好實驗材料[31]。此外，大型溞是食物鏈的重要組成部分，對維持淡水棲息地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和穩(wěn)態(tài)方面具有至關重要的作用[32]。

目前，可應用于司法鑒定的大型溞毒性試驗主要分為急、慢性毒性和抗氧化系統(tǒng)試驗3種。大型溞的急性毒性試驗應用廣泛，技術成熟，操作難度小，靈敏度較高。大型溞慢性毒性試驗毒性作用遲緩，短時間內不會致死，其敏感指標是生長發(fā)育狀況及繁殖能力，是評估生物種群增長能力的主要參數[33-34]。慢性毒性測試中表現出的明顯生殖損傷，可用于證明污染物對其種群安全具有潛在威脅，存在一定的水生生態(tài)風險。此外，環(huán)境中有毒污染物極有可能會對生物的抗氧化防御體系產生影響，造成潛伏的、長期的慢性損害，這種潛在損害可通過大型溞抗氧化系統(tǒng)試驗進行檢測。然而，在實際操作中，溞類由于體型較小而導致觀測難度較大，尤其在慢性毒性試驗中觀察大型溞畸形時，由于溞在水體中游動速度較快，體型較小，畸形表現不統(tǒng)一，導致觀測和操作難度較大。如圖3～圖5所示，大型溞幼溞的常見畸形有尾刺彎曲，第二觸角發(fā)育不全，附肢發(fā)育不全等。幼溞尾刺彎曲是常見的畸形，部分彎曲在成年時會恢復，但彎曲程度較大的基本不會恢復；第二觸角發(fā)育不全為較嚴重的畸形，影響其游泳，通過觀察幼溞的游泳姿勢可以發(fā)現該種畸形的幼溞，此種畸形一般不會恢復；幼溞附肢發(fā)育不全為嚴重畸形，此種幼溞一般存在于瓶底，存活時間較短，無法正常游動。對于存在致畸性的環(huán)境污染物，其慢性毒性試驗中幼溞往往會出現不同情況的畸形。如圖6所示，唑啉草酯對大型溞的慢性毒性實驗中出現了不同情況的畸形。

圖3 幼溞尾刺彎曲Fig. 3 The tail spines of Daphnia magna are curved

圖4 幼溞第二觸角發(fā)育不完全Fig. 4 The second antenna of Daphnia magnais underdeveloped

圖5 幼溞附肢發(fā)育不全Fig. 5 The appendages of Daphnia magna are underdeveloped

圖6 以唑啉草酯為檢材的慢性毒性實驗中子代幼溞不同的畸形情況Fig. 6 Different deformities of the progeny of Daphniamagna in the chronic toxicity test with pinoxaden

1.4 魚類（Fish）

魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對維持水生態(tài)系統(tǒng)的功能完整性具有重要作用。同時，魚類也是水質基準推導中所必需的一類生物，美國、澳大利亞和歐盟等發(fā)達國家或地區(qū)的水質基準研究中均要求使用魚類的毒性數據以加強對水域的保護[35]。斑馬魚、黑頭軟口鰷、食蚊魚、孔雀魚及日本青鳉是國際公認的淡水生態(tài)毒理學研究模型[36]。

魚類生物毒性試驗多以斑馬魚及其胚胎為受試生物進行急性、慢性毒性試驗。斑馬魚毒性評價模型集合了在體動物與體外細胞模型的優(yōu)勢，具有高效、低成本的特點，在國外已成為化合物早期安全性快速甄別的有效模型[37]。作為一種整體動物模型，斑馬魚能夠全面地檢測評估化合物的活性和毒副作用。其次，由于斑馬魚基因組與人類染色體基因在多個位點具有保守共線性，與人類基因組具有87.0%的相似度，所以斑馬魚作為模式生物得出的試驗數據也可以為污染物對人體毒副作用研究提供思路[38-39]。再次，斑馬魚大多數器官的功能與人類器官相同，并表現出良好的生理功能，斑馬魚等身體透明的魚類在毒性試驗中可以較方便觀測到污染物對其器官的影響，對于可能有環(huán)境污染物導致的癌變和畸形具有很好的參考價值[38]。此外，魚類在研究污染物生殖毒性方面具有獨到的優(yōu)勢，大部分魚類體外受精、體外發(fā)育、胚體透明且繁殖量大，便于開展生殖毒性的研究，且研究結果可以很大程度上用于推斷環(huán)境污染物對脊椎動物生殖發(fā)育的影響。但是，斑馬魚在毒性評價中的靈敏度略低于發(fā)光細菌、藻類和溞類[40-41]。

當前，魚類在城鎮(zhèn)污水檢測中應用成熟，于彩虹等[42]以日本青鳉為受試生物對城鎮(zhèn)污水處理廠進出水進行檢測，發(fā)現胚胎致死效應及胚胎發(fā)育致畸效應；劉存歧等[43]以斑馬魚為受試生物評估城市污水處理廠深度處理對污水毒性的削減情況。除常用的魚類急性毒性試驗外，魚胚胎毒性試驗也被視為可以替代動物模型進行各種類型環(huán)境評估的靈敏科學方法[40]，通過魚類行為法實時監(jiān)測水質的方法在國內也得到了應用與發(fā)展。

1.5 蝦類（Shrimp）

在《技術指南》所推薦的試驗準則《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則 第 21 部分：大型甲殼類生物毒性試驗》（GB/T 31270.21）中，日本沼蝦、中華鋸齒米蝦或中華絨螯蟹為受試生物。蝦類作為大型甲殼類的重要部分，是生態(tài)系統(tǒng)中節(jié)肢動物門的典型代表。大多數蝦類能在水底生物和浮游生物之間形成紐帶，是海洋生物鏈中的重要環(huán)節(jié)，以對蝦、日本沼蝦為代表的蝦類產品在漁業(yè)中也占據重要位置。相較于其他水生生物模型，蝦類具有體型大、生命力強、易于解剖和觀察的優(yōu)勢，所以其更易用于測試污染物對內臟的毒性作用以及氧化損傷。李磊等[44]為了定量評價苯并（a）芘對脊尾白蝦的毒性效應，采用水體暴露實驗，研究了脊尾白蝦肝胰臟、肌肉組織的5種生物標志物的毒性響應，并應用綜合生物標志物響應（IBR）定量評價了苯并（a）芘對肝胰臟、肌肉組織的毒性差異。劉祥等[45]以日本沼蝦為受試生物，深入探討水體不同濃度重金屬聯合對水生生物的慢性毒性機制，研究不同濃度的Cd和Pb單一及聯合暴露對日本沼蝦的氧化損傷及交互作用。

此外，糠蝦也是生物毒性試驗中的典型代表，其具有生活周期短、生長快、易培養(yǎng)、對毒物敏感等特點。糠蝦法以巴西擬糠蝦為受試生物，是由美國石油學會和美國實驗與材料學會推薦的一種用于評價鉆井液體系及各組分生物毒性的標準方法，幾乎可以用于檢測所有油田化學品的生物毒性。張穎等[46]等采用糠蝦法對由不同類型減阻劑（目前國內常用的）配制的滑溜水進行毒性測試。但是，因巴西擬糠蝦在我國無分布，國內應用較廣的為黑褐新糠蝦（圖7），盡管巴西擬糠蝦和黑褐新糠蝦對標準毒物的敏感性在同一個數量級上，但同一種毒物對2種生物的毒性仍然存在一定差異[47]。

圖7 黑褐新糠蝦的雌性（a）和雄性成蝦（b）[47]Fig. 7 Neomysis awatschensis female （a） and male （b） [47]

1.6 各種模式生物的優(yōu)勢與不足（Advantages and disadvantages of various test models）

如表2所示，各類水生生物毒性試驗的模式生物在生物毒性評價中具有不同優(yōu)勢與不足。

表2 各類水生模式生物的優(yōu)勢與不足Table 2 Advantages and disadvantages of various aquatic test models

續(xù)表2

發(fā)光細菌法技術成熟，適用范圍廣。同時，依據發(fā)光細菌法建立的快檢技術可以作為初篩手段以滿足司法鑒定時效性的要求，發(fā)光細菌對污染物尤其是重金屬污染物靈敏度較高。但發(fā)光細菌作為商業(yè)領域應用較成熟的毒性試驗方法，部分菌種受市場影響較大，可能出現菌種短缺的情況。此外，在污水毒性檢測中，污水中的某些營養(yǎng)物質會促進發(fā)光細菌發(fā)光，對測試結果產生影響[18,48-49]。

藻類在毒性試驗中應用廣泛，且藻類繁殖快、易獲取、培養(yǎng)成本低，可以滿足司法鑒定的經濟利益。此外，在毒性試驗中，藻類作為單細胞生物比表面積大，且能夠觀察細胞水平的中毒癥狀[16]。但藻類生長抑制試驗一般需要96 h，較其他水生生物的急性毒性試驗而言，時間較長。同時，低劑量重金屬污染物和有機磷農藥會對其生長起到促進作用[50-52]，劉存岐等[43]在污水毒性測試中發(fā)現總磷的濃度與羊角月芽藻毒性呈顯著負相關。需要注意，近年來在毒性評價體系中應用廣泛的藻類光合作用抑制試驗并未引入到《技術指南》調查評估推薦方法中。

溞類作為國際上應用較早的模式生物，相關試驗技術成熟，國內外均有一定數量可參考的技術標準，且溞類生殖周期性短、繁殖速度快便于進行遺傳毒性試驗[32-34,53]。但是，溞類體型較小，即使是成年大型溞體長也僅在2.2～4 mm，觀測難度較大。

魚類可供選擇的受試生物較多，無論是模式生物斑馬魚還是我國特有淡水魚稀有鮈鯽，均有成熟的技術標準。同時，魚類作為卵生動物易于進行生殖毒性試驗。此外，斑馬魚身體透明且與人體具有較高的基因相似度，在試驗中可以觀測到污染物對其器官的影響，易于分析污染物的毒理作用與積累路徑，并對人類生命健康的保護具有參考價值[39-41]。但是，斑馬魚在一些污染物生物毒性試驗中靈敏度較發(fā)光細菌、藻類而言較低。其次，部分魚類養(yǎng)殖成本較高，對養(yǎng)殖空間有要求，養(yǎng)殖技術難度大[42]。

應用于毒性試驗的蝦類，一般為大型甲殼類，體型較大，易于觀察，方便統(tǒng)計。以對蝦、沼蝦為受試生物的毒性試驗結果對水產養(yǎng)殖具有重要參考意義[54]。此外，糠蝦法近乎可應用于檢測所有的油田化學品的生物毒性檢測。但蝦類對污染物的靈敏度較低，且國內可參考標準較少，黑褐新糠蝦的馴化過程也較為繁瑣，養(yǎng)殖成本較高[47]。

結合司法實踐而言，由于環(huán)境損害司法鑒定是應用于具體案件的法律服務事項，鑒定人需要參照標準方法、結合案件具體情況就模式生物的選擇、試驗方法的調整和證明路徑的設計等方面進行合理研判及選擇。在司法實踐中，生物毒性評價方法多用于確定原因或排除化學物質污染引起的生物多樣性改變。此外，由于不同營養(yǎng)級生物在生態(tài)系統(tǒng)中所處的位置不同，當采用一組不同營養(yǎng)級的生物毒性測試數據時，可以在一定程度上反映環(huán)境污染物對生態(tài)系統(tǒng)結構的影響。在以水生生物毒性試驗為基礎進行的生物多樣性調查中，由藻-溞-魚不同營養(yǎng)級生物構成的測試可反映環(huán)境污染物對水生食物鏈結構的影響，進而推斷出其對生物多樣性的影響。需要注意，由于細菌生存所必需的生境最小閾值較小，其在生態(tài)系統(tǒng)中生態(tài)位較低，其毒性試驗數據對于生物多樣性評價參考意義不大，所以一般不置于成組參數方法當中。

2 水生生物毒性試驗的應用（Application of aquatic toxicity test）

鑒定意見作為科學證據是事實認定的關鍵，盡管以理化分析為主的傳統(tǒng)環(huán)境損害司法鑒定方法能對污染物進行定性和定量分析，但無法全面、直觀地反映污染物對生態(tài)環(huán)境的綜合影響，故生物毒性評價方法在環(huán)境損害司法鑒定中有不可取代的重要位置。其具體原因如下：首先，增加生物毒性試驗和相關評價環(huán)節(jié)，可以克服傳統(tǒng)檢測方法的缺點，通過水生生物受污染物毒害后的變化反映出有毒物質的劑量與生物之間的關系，為污染物毒性的綜合評價提供了基礎。其次，生物毒性評價方法彌補了傳統(tǒng)方法的不足，可有效檢測環(huán)境中所有共存污染物的綜合生物效應，對推進環(huán)境損害司法鑒定的科學化進程具有重要意義。最后，其完善了司法實踐領域環(huán)境類案件的毒性證明路徑，在刑事領域，由于水生生物毒性評價方法廣泛適用于各類化學品的毒性認定，可應用于污染物性質、種類難以確定的疑難案件；在民事領域，當生物多樣性受損且明確是由于化學污染引起時，不同的生物毒性測試結果能夠大致判斷污染性質。例如，發(fā)光菌測試主要代表殺菌劑的影響；浮游植物測試主要代表除草劑的影響；殺蟲劑大多作用于神經系統(tǒng)，浮游動物和魚的測試代表對魚類和人類的健康影響。此外，水生生物毒性試驗相關方法在生態(tài)環(huán)境研究領域已經被廣泛應用，受試生物也依據污染物種類不同，不斷豐富且得到了發(fā)展。

2.1 無機污染物（Inorganic pollutant）

無機污染物指除碳元素與非金屬結合而成的絕大多數化合物以外的，且對環(huán)境造成污染的各種元素及其化合物[5]。環(huán)境污染中的無機污染物主要分為金屬類污染物和非金屬類污染物，在生態(tài)環(huán)境損害中金屬類污染物主要指重金屬污染物[55]。

2.1.1 重金屬污染物

重金屬污染是指由重金屬及其化合物造成的環(huán)境污染。一般認為，重金屬不僅包括密度>4.5 g·cm-3的金屬元素，還包括生態(tài)毒性較高的類金屬元素[5]。依據《重金屬污染綜合防治規(guī)劃》，在環(huán)境污染方面，當前所關注的重金屬主要指汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生態(tài)毒性顯著的重金屬。重金屬在自然水域中含量極小，主要是由采礦、廢氣排放、污水灌溉和使用重金屬制品等因素所致[55-56]。針對重金屬污染問題，我國重點防控的行業(yè)有重有色金屬礦采選業(yè)、重有色金屬冶煉業(yè)、皮革及其制品業(yè)、化學原料及化學制品制造業(yè)等。

由表3可知，水生生物毒性試驗在重金屬污染領域應用廣泛。各種水生生物對重金屬污染的敏感度不盡相同，具體試驗要根據污染物的類型科學合理地選擇受試生物。當前，對于水生生物毒性試驗在重金屬污染方面的研究重點集中在6個方面：第一，不同金屬離子對同一水生生物的毒性作用排序及快檢技術，如陳速敏等[57]以某鍍鋅工廠土壤污染案件為例，在檢測分析金屬濃度水平的同時，建立了基于發(fā)光細菌（青?；【鶴67）急性毒性試驗的生物毒性快速檢測方法，利用逐步多元回歸找出主導污染物；第二，低濃度重金屬離子對藻類生長的促進作用，如劉璐等[51]發(fā)現低濃度重金屬鉛對藻類生長具有促進作用；第三，不同金屬離子之間、金屬離子與農藥之間、金屬離子與納米TiO2間的聯合作用，如胡冰等[58]發(fā)現納米TiO2分別和Cu2+、Zn2+對小球藻和新月菱形藻的聯合毒性效應均表現為拮抗作用；第四，重金屬離子對水生生物光合作用以及氧化還原系統(tǒng)的抑制作用；第五，重金屬離子對水生動物的神經發(fā)育毒性和生殖毒性[59]；第六，不同水體硬度條件下重金屬離子對魚類的急性毒性，研究發(fā)現重金屬對魚類的毒性會因水體硬度的升高而削弱[60-61]。

2.1.2 非金屬類無機污染

非金屬類無機污染物即不含金屬元素的無機污染物，其元素構成均為非金屬元素。非金屬元素為具有非金屬性質的元素，即沒有金屬光澤、缺乏延展性的元素，其在自然環(huán)境和生態(tài)環(huán)境間的變化、影響和交互作用方面具有重要地位[5]。環(huán)境中某些非金屬元素是重要的污染元素，如氯、氟和硫等[5]。常見的非金屬無機污染物主要包括含碳、硅的無機污染物，含氮、砷的無機污染物，含氧、硫、硒的無機污染物和含氟、溴的無機污染物。目前，對人體和自然環(huán)境危害較大的無機污染物主要有氮氧化物、二氧化硫、氰化物、砷和氟等[55]。

在實踐中，較重金屬污染而言，非金屬類無機污染物的監(jiān)測大多依靠理化分析方法，水生生物模型應用較少。然而，由于氰化物對水生生物毒性較大；所以相較于其他非金屬無機污染物，針對氰化物水生生物毒性評價方面的研究較多。天然水中的氰化物大多來自含氰廢水的污染，當水體環(huán)境中氰化物的濃度超過0.1 mg·L-1時就能導致魚類行為異常甚至死亡[77]。此外，大型溞也可用于黃金冶煉工藝中含氰廢水的毒性評價，筆者所在項目組曾以大型溞為受試生物進行急性毒性試驗評價含氰化物冶金廢水的毒性，并結合理化分析方法得出科學、全面的鑒定意見。

2.2 有機污染物（Organic pollutant）

有機污染物是指造成環(huán)境污染和對生態(tài)系統(tǒng)產生有害影響的有機化合物，可分為天然有機污染物和人工合成有機污染物。前者主要由生物代謝活動或其他生物化學過程而產生，如黃曲霉素、氨基甲酸乙酯和黃樟素等；后者是隨著現代化合成化學工業(yè)的興起而產生的，如農藥、藥品和塑料等。部分有機污染物在環(huán)境中發(fā)生化學反應會轉化成危害更大、毒性更強的二次污染物，如黃樟素和黃曲霉素B1與氧化劑反應會生成強致癌物環(huán)氧黃樟素和環(huán)氧黃曲霉素B1[5]。

當前，對生態(tài)環(huán)境影響較大的有機污染物主要分為3類：第一，營養(yǎng)型有機污染物，主要包括耗氧及富營養(yǎng)有機污染物，耗氧有機污染物包括碳水化合物、蛋白質、氨基酸、油脂和酯類等，其濃度既可用五日生化需氧量（BOD5）來表示，也可用總需氧量（TOD）、總有機碳（TOC）和化學需氧量（COD）等指標綜合評價；第二，揮發(fā)性有機污染物，是指對環(huán)境存在危害的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds, VOCs），其已經成為人類健康及大氣環(huán)境的公害，是《大氣污染防治法》的重要管制對象；第三，持久性有機污染物（persistent organism pollutants, POPs），它是指在環(huán)境中難以通過物理、化學或生物作用降解的有機污染物，其具有毒性、持久性、生物積累性和遠距離遷移性等特點，是《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》（以下簡稱《斯德哥爾摩公約》）的重要協約內容[5,78]。

表3 各類水生模式生物在重金屬污染領域的研究與應用Table 3 Research and application of various aquatic test models in the field of heavy metal pollution

續(xù)表3

2.2.1 營養(yǎng)型有機污染物

營養(yǎng)型有機污染物是導致水體富營養(yǎng)化的重要原因，是環(huán)境治理的難題，也是水質監(jiān)測的重點。富含氮、磷等營養(yǎng)物質的工業(yè)廢水和生活廢水是造成水體富營養(yǎng)化的主要污染物[79]，也是黑臭水問題的重要誘因。依據生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《湖泊營養(yǎng)物基準制定技術指南》（HJ 838—2017），我國通常使用理化指標實現富營養(yǎng)化監(jiān)測，如氮、磷、生化需氧量、pH值、透明度和葉綠素a等。20世紀80年代，美國環(huán)境保護局在WET中引入了水生生物毒性評價方法[14]，He等[41]在黑臭水的治理中也使用了多種水生生物進行毒性評價。適當引入生物毒性評價結果，結合理化分析方法，可以綜合反映營養(yǎng)型有機污染物對水生生物的不利影響，并可對毒性成因進行科學分析。呂向立等[80]以廣州市和佛山市的5個城市污水處理廠的污泥為實驗對象，選取費氏弧菌為受試對象，結合化學分析方法，研究廣州區(qū)域周邊污水污泥浸出液的生物毒性效應；武毛妮等[81]采用OECD 201及《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中的標準方法，選用普通小球藻對生活污水處理廠各處理單元進出水的生物毒性進行檢測，對污水的生物毒性成因進行分析；孫曉怡等[82]以斑馬魚為受試生物，對多個重點工業(yè)污染源排污口進行毒性評價，其研究表明在21個污水排放口中，低毒以上9個、劇毒1個。

2.2.2 揮發(fā)性有機物

VOCs的管控已成為現階段我國大氣環(huán)境領域的工作重點，但我國尚未明確環(huán)保管理工作中的VOCs國家定義[83]。美國材料試驗學會、美國環(huán)境保護局和世界衛(wèi)生組織對于VOCs的定義存在一定差別。廣義上，VOCs是所有參加氣象光化學反應的有機化合物的總稱，目前普遍認為，VOCs是指沸點等于或低于250 ℃的有機物[5,55]。VOCs工業(yè)源主要包括石油煉制與石油化工、煤炭加工與轉化等含VOCs原料的生產行業(yè)，油類（燃油、溶劑等）儲存、運輸和銷售過程，涂料、油墨、膠粘劑、農藥等以VOCs為原料的生產行業(yè)，涂裝、印刷、粘合、工業(yè)清洗等含VOCs產品的使用過程；生活源包括建筑裝飾裝修、餐飲服務和服裝干洗[84]。

VOCs是大氣中二次有機氣溶膠的重要前體物，是生成細顆粒物（PM2.5）和臭氧（O3）的共同前體物[85]，加強VOCs治理是現階段協同治理PM2.5和O3污染的有效途徑。VOCs是我國《大氣污染防治法》規(guī)定的協同控制污染物，北京、河北等地相繼對VOCs展開了專項整治項目。當前，環(huán)境中VOCs的監(jiān)測方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法和質子轉移反應質譜[86]。就水污染案件司法鑒定而言，由于水中的VOCs一般來自于企業(yè)排放的廢水和廢氣，可以通過液-液萃取法、固相微萃取法、頂空法和吹掃捕集法進行預處理[87]，再進行色譜或質譜分析，同時可結合水生生物毒性試驗對廢水和廢氣進行綜合評價，以評估其對水生生物的毒性等級。

2.2.3 持久性有機污染物

我國作為《斯德哥爾摩公約》締約國，于2008年啟動中國履行斯德哥爾摩公約能力建設項目，并發(fā)布了中國履行《斯德哥爾摩公約》的國家實施計劃。目前，上海等地制定了《地方政府執(zhí)行“關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約”實施計劃》，重慶等地設立了POPs履約能力建設項目示范區(qū)（縣）。就生態(tài)環(huán)境而言，海洋、水庫和湖泊等水體是POPs的重要歸宿，POPs通過直接排放、干濕沉降及地表徑流等方式進入水環(huán)境并被水生生物吸收、利用、傳遞，通過生物積累對生態(tài)系統(tǒng)及人體健康構成較大危害[88]。

王夢圓等[89]總結整理了斑馬魚、青鳉魚、非洲爪蟾、稀有鮈鯽和大型溞等水生模式生物在持久性有機污染物毒理學評價中的研究進展。由于斑馬魚胚胎體外發(fā)育、透明且易觀察，在環(huán)境損害司法鑒定中，推薦使用斑馬魚評價POPs的生物毒性。目前以斑馬魚胚胎為模型開展的研究較為廣泛[90]，且有明確的國家標準。此外，青鳉魚的胚胎能夠對二噁英類化合物作出敏感應答[91]。大型溞等浮游動物作為重要的初級消費者，在生態(tài)環(huán)境的物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用，其對環(huán)境中POPs物質十分敏感，基于大型溞的毒性效應監(jiān)測評價能夠預防此類物質對營養(yǎng)層級較高的生物體的潛在危害[92-93]。

3 建議與總結（Suggestions and conclusions）

鑒于現階段水生生物毒性試驗理論及方法研究現狀，為滿足我國環(huán)境訴訟對于科學證據的迫切需求，現提出如下建議：首先，當前《技術指南》中推薦的受試生物集中在發(fā)光細菌、藻類、魚類、溞類和大型甲殼類，具有一定局限性，應根據司法實踐的要求進行擴充。因環(huán)境損害司法鑒定具有案件針對性，不同案件涉及的生態(tài)系統(tǒng)、優(yōu)勢物種、受保護物種類型多樣，不盡相同。對于基礎研究扎實且已被廣泛應用于水生生物學、發(fā)育生物學、遺傳學和毒理學等領域的實驗動物，可考慮引入環(huán)境損害司法鑒定中水生生物毒性試驗的范疇，如鹵蟲[94]、秀麗線蟲[95-96]和泥鰍等；其次，針對油田化學劑生物毒性評價的糠蝦法，也可以作為司法鑒定中針對油田化學劑污染以及甲殼類水產品養(yǎng)殖業(yè)污染的調查方法；再次，當前環(huán)境損害司法鑒定中，水生生物毒性試驗方法大多應用于水體污染的調查評估中，建議在大氣污染和輻射污染領域也可嘗試應用發(fā)光細菌法等水生生物毒性試驗方法進行毒性評價，以作為鑒定意見的參考[20,97]；此外，我國已初步建立起環(huán)境損害司法鑒定統(tǒng)一登記制度以及生態(tài)環(huán)境損害賠償鑒定評估的基本技術框架，之后應根據水生生物毒性試驗在司法鑒定中的應用情況，針對采用水生生物毒性試驗作為主要分析方法的鑒定意見，在受試生物選擇、標準方法選擇及調整、結果分析、鑒定人員出庭等方面建立科學、統(tǒng)一的證據標準，推動相關技術指南與司法制度的有效銜接；最后，當前《技術指南》推薦的方法大多為急性毒性試驗，無法反映污染物的慢性毒性效應，對于疑難案件以及存在POPs的水體污染案件，針對其危害具有潛伏性、持久性和生物積累性的特點，建議引入慢性毒性試驗環(huán)節(jié)以進行科學、全面的評估。

環(huán)境損害司法鑒定是環(huán)境侵權案件事實認定的重要依據。雖然理化分析方法應用廣泛且技術成熟，但是因為生物環(huán)境本身的復雜性、系統(tǒng)性以及損害結果潛伏性等特點，僅依據理化分析試驗出具的鑒定意見在科學性上存在不足。因此，應當結合生物毒性試驗進行全面、綜合的分析。就水生生物毒性評價方法而言，應當依據案件發(fā)生的環(huán)境以及具體情況選擇合適的受試生物，對于較為復雜的案件應盡量采用發(fā)光細菌、斑馬魚和大型溞等模式生物進行試驗。此外，對可能致癌、致畸以及影響種群繁殖的污染物，應以慢性毒性試驗或生殖毒性實驗的結論佐證。同時，由于環(huán)境損害司法鑒定服務于具體案件，水生生物毒性試驗的設計應以標準為依據，考慮案件發(fā)生地的溫度、光照和水體溶氧率等條件進行設計，同時在鑒定意見中予以說明。最后，如有條件，可進行多次或多種受試生物的毒性評價進行驗證，以提高鑒定意見的科學性和可信度。