陳 倩，黃小雙，楊永暉，耿 凱，劉存斌，李 韜，吳亮亮，林秀華，施婧婧

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，合肥 230061)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種中老年人常見的慢性退行性疾病，我國KOA的發(fā)病率為5.4%～30.5%[1，2]。目前西藥治療KOA存在長期療效較差、胃腸道損害以及腎損傷等弊端[3，4]，針刀治療KOA臨床療效良好，可以明顯改善KOA疼痛和功能障礙等癥狀，具有安全性高、起效快、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)[5，6]。

針刀治療KOA的作用機(jī)制研究，目前大多圍繞肌肉力學(xué)、細(xì)胞免疫反應(yīng)、炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等方面開展[7-13]。膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡是KOA的主要發(fā)病因素之一，而細(xì)胞凋亡與Ca2+的濃度密切相關(guān)[14，15]。大量的Ca2+可以促進(jìn)凋亡加速[16]，加快膝關(guān)節(jié)軟骨退變與損傷。在Ca2+釋放過程中，鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)、鈣蛋白酶(Calpain)數(shù)量會(huì)變多，而鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin)數(shù)量會(huì)減少。鑒于針刀調(diào)控膝軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度以抑制凋亡的機(jī)制研究尚不多見，本研究建立KOA大鼠模型，觀察大鼠膝軟骨細(xì)胞Ca2+含量、Calmodulin、Calpain、Calreticulin及Caspase家族的表達(dá)水平，旨在探討針刀療法是否能夠通過調(diào)節(jié)膝軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，進(jìn)而抑制膝軟骨細(xì)胞凋亡，為針刀治療KOA提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)AHUCM-rats-2020011。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用SD清潔型雄性大鼠72只，體質(zhì)量(250±20)g，購自江蘇省邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(蘇)2014-0005。飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃、濕度(55±15)%、光照與黑暗12 h、普通標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由活動(dòng)、自由飲食與攝水的環(huán)境中。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol(Life technogie公司，貨號(hào)15596026)；熒光染料試劑盒(novoprotein公司，貨號(hào)E096-01B)；預(yù)染蛋白Marker與ECL超敏發(fā)光試劑盒(Thermo公司，貨號(hào)26616、34095)；β-Actin、山羊抗小鼠IgG與山羊抗兔IgG(Zsbio公司，貨號(hào)TA-09、ZB-2305、ZB-2301)；Caspase-3、Caspase-9(abcam公司，貨號(hào)ab184787、ab202068)；Caspase-12(Bioss公司，貨號(hào)bs-1105R)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號(hào)D5796)；鈣離子檢測試劑盒(碧云天公司，貨號(hào)S1052)；胎牛血清(Gibco公司，貨號(hào)04-001-1ACS)；DAPI染色液、抗熒光淬滅封片液(Beyotime公司，貨號(hào)C1005、P012)；FITC(abcam公司，貨號(hào)ab6785)；熒光一抗Calmodulin、Calreticulin(abcam公司，貨號(hào)ab61001、ab92516)，Calpain(Bioss公司，貨號(hào)bs-1099R)；針刀(江西老宗醫(yī)，0.35 mm×30 mm)。

Olympus CX4光學(xué)顯微鏡、JEM1400 透射電鏡(日本電子公司)；A001-1-1102流式儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)；OD-1000超微量分光光度計(jì)(南京五義科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物選模分組與制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、針刀組和藥物組各18只，除正常組外，其余3組均進(jìn)行KOA鼠造模。造模采用膝關(guān)節(jié)腔藥物注射法[17]，預(yù)先調(diào)配2%(w/v)木瓜蛋白酶和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合液，充分混勻后靜置30 min，4 ℃冷藏備用。每周第1、3、5天注射3%戊巴比妥鈉(0.3 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，按0.1 mL/kg 劑量在大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射建立模型，建模時(shí)間共4周，造模成功后休息1周，待動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行干預(yù)治療。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)SD大鼠的精神、飲食及活動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。4周后大鼠造模側(cè)出現(xiàn)屈伸功能障礙、跳步、拖步、活動(dòng)減少，lequesne MG評(píng)分≥6分則為造模成功。

1.4 干預(yù)方法

正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)；模型組造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)；藥物組造模成功1周后患膝局部外抹雙氯芬酸二已胺乳膠劑，每日2次，連續(xù)4周；針刀組造模成功1周后行針刀干預(yù)，每周治療1次，連續(xù)4周。

針刀操作方法：在左膝關(guān)節(jié)周圍股四頭肌腱和內(nèi)、外側(cè)副韌帶附近尋找條索或結(jié)節(jié)狀物作為針刀的進(jìn)針點(diǎn)，以手術(shù)用無菌記號(hào)筆標(biāo)記，常規(guī)備皮、消毒后依次行針刀治療，即將刀口線平行于下肢縱軸垂直于皮膚快速刺入，到達(dá)骨面后稍微上提針刀并旋轉(zhuǎn)90°，使針刀與下肢縱軸垂直，快速切割條索或結(jié)節(jié)狀物3～5刀，出刀后以無菌紗布?jí)浩戎寡?/p>

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 國際骨關(guān)節(jié)炎量表評(píng)分(lequesne MG) 各組大鼠分別在造模前、造模后、干預(yù)后進(jìn)行改良lequesne MG評(píng)分：局部疼痛刺激反應(yīng)(0～3分)，步態(tài)改變(0～3分)，關(guān)節(jié)活動(dòng)度(0～3分)，關(guān)節(jié)腫脹(0～2分)，總分范圍為0～11分。

1.5.2 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞HE染色 每組隨機(jī)選取2只大鼠用0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，在鼠板上固定，用23號(hào)手術(shù)刀片打開膝關(guān)節(jié)，切除髕骨暴露大鼠左膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)和股骨下髁的軟骨，快速切取股骨內(nèi)、外側(cè)髁處2 mm×2 mm大小的新鮮軟骨組織，將標(biāo)本投入10%甲醛溶液中固定，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量改變。

1.5.3 膝關(guān)節(jié)軟骨電鏡檢測 每組隨機(jī)選取2只大鼠，同上方法快速切取股骨內(nèi)、外側(cè)髁處1 mm×1 mm×1 mm的新鮮軟骨組織，并固定在電鏡固定液中。按照常規(guī)透射電鏡樣本制備流程進(jìn)行漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、超薄切片，經(jīng)檸檬酸鉛、醋酸鈾雙重染色，在JEM1400型透射電鏡下觀察軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)并攝片。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Ca2+濃度 大鼠膝軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng)：每組隨機(jī)選取4只大鼠，無菌操作下選取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨。提前準(zhǔn)備好胰酶、含0.02%膠原酶II和15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液作為消化液(37 ℃預(yù)熱)。將軟骨依次放到裝有PBS和無血清DMEM高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中涮洗，洗去可能殘留的血污和脂肪。把軟骨切割成小塊，放入1.5 mL離心管中加入少量的PBS剪碎，將剪碎的軟骨倒入0.25%的胰酶中消化1～2 h，離心、棄掉胰酶消化液，向含有軟骨塊的沉淀中直接加入膠原酶消化液過夜，沉淀加入含15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液清洗一次，重懸之后直接接種到培養(yǎng)皿中等待細(xì)胞爬出。細(xì)胞匯合度達(dá)到約90%以上時(shí)用胰酶將細(xì)胞消化、傳代。

流式前處理：用PBS洗滌細(xì)胞2次，按照1∶1000稀釋Ca2+母液，將稀釋好的Ca2+溶液重懸細(xì)胞沉淀，避光孵育后離心收集沉淀Ca2+細(xì)胞。處理完畢后進(jìn)行流式檢測，用Ca2+-FITC(激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm)的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 每組選取3只大鼠，同上方法選取大鼠左膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)、外髁以及脛骨平臺(tái)處的軟骨，置于-80 ℃保存待測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12基因表達(dá)水平，取50～100 mg組織剪碎后液氮磨勻，Trizol法提取組織中總RNA，分光光度計(jì)計(jì)算RNA的純度及濃度；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄使RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，其中總RNA質(zhì)量約為1 μg進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL，cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green mixture 5 μL、RNase Free water 2 μL；反應(yīng)結(jié)束后，以2-ΔΔCT表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由Sangon Biotech公司合成(見表1)。

表1 目的基因引物序列

1.5.6 Western blot檢測 每組選取3只大鼠，同上方法選取大鼠左膝關(guān)節(jié)軟骨，選取組織約100 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，收集蛋白樣品變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。選擇合適的一抗稀釋液(Caspase-3 1∶2000，Caspase-9 1∶2000，Caspase-12 1∶1000)、二抗稀釋液(1∶20000)孵育，ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)，采用各自的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行膠片條帶的分析。

1.5.7 免疫熒光組化 每組隨機(jī)選取4只大鼠，同上方法選取大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨制作切片(厚度為3 μm)，干燥烘烤，二甲苯透明，梯度脫水，抗原高壓修復(fù)，山羊血清封閉，一抗(Calmodulin1∶200、Calpain1∶200、Calreticulin1∶300)孵育1 h，再加入二抗(1∶400)孵育、沖洗、甩干，用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片，最后數(shù)字切片掃描儀掃描熒光切片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠lequesne MG比較

圖1示，治療前3組大鼠lequesne MG評(píng)分差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與干預(yù)前比較，針刀組和藥物組干預(yù)后lequesne MG評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，針刀組和藥物組干預(yù)后lequesne MG評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：1)與模型組治療后比較：P<0.05；與本組治療前比較：2)P<0.05

2.2 HE染色結(jié)果

圖2示，正常組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多且排列整齊。模型組與正常組比較，大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面粗糙不平滑，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少且排列混亂。針刀組和藥物組與模型組比較，大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面較為完整且平滑，軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多，排列順序也較整齊規(guī)律。

注：A.正常組；B.模型組；C.藥物組；D.針刀組；圖2-B為圖2-A中藍(lán)框部分的放大圖

2.3 關(guān)節(jié)軟骨電鏡結(jié)果

圖3示，正常組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布勻稱，細(xì)胞核膜完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體結(jié)構(gòu)正常；模型組細(xì)胞染色質(zhì)分布不均勻，細(xì)胞核膜皺縮嚴(yán)重，出現(xiàn)核膜染色質(zhì)邊集形態(tài)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有空泡的形成；針刀組和藥物組與模型組比較，細(xì)胞膜染色質(zhì)較均勻，核膜形態(tài)較正常，無邊集形態(tài)，可見少量的空泡和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張形態(tài)。

注：A正常組；B模型組；C藥物組；D針刀組；紅色箭頭指向細(xì)胞核

2.4 Ca2+檢測結(jié)果

圖4示，橫坐標(biāo)為前向角代表細(xì)胞大小。縱坐標(biāo)為側(cè)向角，代表細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜程度。圖框中紅色部分為細(xì)胞離散后可作為Ca2+流式檢測的部分細(xì)胞。圖5示，橫坐標(biāo)代表Ca2+平均熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量。與正常組比較，模型組流式圖整體向橫坐標(biāo)右側(cè)平移；與模型組比較，藥物組和針刀組流式圖整體向橫坐標(biāo)左側(cè)平移；與藥物組比較，針刀組流式圖整體向橫坐標(biāo)左側(cè)平移。

圖4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ca2+流式散點(diǎn)圖(n=4)

圖5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ca2+熒光強(qiáng)度流式圖(n=4)

圖6示，Ca2+的熒光強(qiáng)度可反映Ca2+濃度，Ca2+的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)則Ca2+濃度越高。與正常組比較，模型組的Ca2+平均熒光密度顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，針刀組和藥物組的Ca2+平均光密度明顯低于模型組(P<0.05)；與藥物組比較，針刀組的Ca2+平均光密度低于藥物組(P<0.05)。

注：與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物組比較：3)P<0.05

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨免疫熒光檢測結(jié)果

DAPI是一種熒光染色劑，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。Calmodulin、Calpain、Calreticulin在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，呈綠色熒光，Merge為藍(lán)色、綠色熒光表達(dá)的組合比較(見圖 7～9)。

圖7 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Calmodulin表達(dá)比較(n=4)

圖8 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Calpain表達(dá)比較(n=4)

圖9 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Calreticulin表達(dá)比較(n=4)

圖7、8示，正常組綠色熒光分布較少，模型組綠色熒光數(shù)量明顯增多；與模型組比較，針刀組和藥物組綠色熒光顯著減少。圖9示，正常組可見較多的綠色熒光，模型組綠色熒光分布明顯減少；針刀組、藥物組與模型組比較，綠色熒光數(shù)量增多。

圖10示，與正常組比較，模型組Calmodulin、Calpain蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Calreticulin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，針刀組和藥物組Calmodulin、Calpain蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Calreticulin蛋白表達(dá)明顯升高。其中，針刀組的Calmodulin、Calpain蛋白表達(dá)低于藥物組(P<0.05)，Calreticulin蛋白表達(dá)高于藥物組(P<0.05)。

注：與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物組比較：3)P<0.05

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖11示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常組(P<0.05)；針刀組、藥物組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P<0.05)，其中針刀組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表達(dá)水平明顯低于藥物組(P<0.05)。

注：與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物組比較：3)P<0.05

2.7 Western blot檢測結(jié)果

圖12示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，針刀組和藥物組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與藥物組比較，針刀組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物組比較：3)P<0.05

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎為常見的慢性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇[18]。針刀療法是中醫(yī)學(xué)治療KOA的一大特色，通過松解肌肉的疤痕、攣縮組織，調(diào)節(jié)肌肉力學(xué)平衡，緩解疼痛并改善膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)度，可以達(dá)到治療KOA的目的。膝軟骨細(xì)胞的凋亡是KOA的重要發(fā)病機(jī)制之一[19]，抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡可以改善軟骨的退變程度治療KOA。

膝軟骨細(xì)胞的凋亡會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞大量減少，從而加重膝軟骨的破壞，加快KOA的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠軟骨面粗糙破損，軟骨細(xì)胞大量減少，排列紊亂無規(guī)律，膝軟骨細(xì)胞核染色分布不均勻，且細(xì)胞核膜固縮現(xiàn)象嚴(yán)重，針刀、藥物干預(yù)后可見大鼠軟骨面平整清晰，軟骨細(xì)胞增多且排列整齊，軟骨細(xì)胞核膜形態(tài)較為正常，提示針刀療法可以抑制膝軟骨細(xì)胞的凋亡，具有促進(jìn)膝軟骨修復(fù)、抑制膝關(guān)節(jié)退行性改變的作用。

研究表明，Ca2+是第二信使，是參與細(xì)胞凋亡的重要物質(zhì)，且Ca2+的濃度越高持續(xù)的時(shí)間越長，越容易促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20-22]。Calmodulin是Ca2+的傳感器，在Ca2+釋放過程中被激活，促使凋亡發(fā)生[23，24]；Calpain是細(xì)胞內(nèi)鈣濃度依賴型中性半胱氨酸內(nèi)肽酶，可以隨Ca2+的濃度升高而升高，裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加快凋亡進(jìn)程[25，26]；Calreticulin是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，與Ca2+的穩(wěn)定性密切相關(guān)[27，28]，通過結(jié)合Ca2+使其濃度降低[29]，減緩凋亡發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Ca2+濃度明顯高于正常大鼠，Calmodulin、Calpain表達(dá)數(shù)量較多，Calreticulin數(shù)量較少，提示膝軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生，KOA進(jìn)展加快。經(jīng)過針刀干預(yù)治療后，Ca2+濃度顯著減少，Calmodulin、Calpain表達(dá)減少，Calreticulin明顯增多，表明針刀治療調(diào)控膝軟骨細(xì)胞中的Ca2+濃度，使Calmodulin、Calpain 和Calreticulin表達(dá)趨于正常水平，進(jìn)而抑制膝軟骨細(xì)胞凋亡。

Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12是促進(jìn)凋亡發(fā)生的重要因子。目前研究表明，Caspase-9為凋亡始動(dòng)子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游；Caspase-3為凋亡效應(yīng)子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，被上游始動(dòng)子激活后會(huì)作用于特異性底物，使得細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；Caspase-12位大鼠體內(nèi)特有，在外源性細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路中起輔助作用[30，31]。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12表達(dá)量較高，針刀干預(yù)后顯著減少，結(jié)合相關(guān)分析認(rèn)為針刀可以抑制Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的激活，從而減緩凋亡的發(fā)生，對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用。

雙氯芬酸二乙胺乳膠劑是一種前列腺素合成的抑制劑，具有消炎、鎮(zhèn)痛的作用[32]。使用雙氯芬酸二乙胺乳膠劑干預(yù)后，KOA大鼠膝軟骨Ca2+的濃度降低，Calmodulin、Calpain表達(dá)減少，Calreticulin表達(dá)增多，表明膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡減少，但針刀療法抑制凋亡的作用優(yōu)于雙氯芬酸二乙胺乳膠劑。針刀療法以經(jīng)筋理論為總綱，以網(wǎng)眼理論為基礎(chǔ)[33]，結(jié)合九針技術(shù)與人體解剖學(xué)，是傳統(tǒng)針灸學(xué)的繼承與發(fā)展。《素問·痿論篇》中提到經(jīng)筋的生理功能“主束骨而利機(jī)關(guān)”，經(jīng)筋病主要表現(xiàn)為經(jīng)筋分布之處的筋肉攣急、掣引、痹痛、轉(zhuǎn)筋、強(qiáng)直、弛緩等。如《靈樞·經(jīng)筋》所言：“經(jīng)筋之病，寒則反折筋急，熱則筋弛縱不收，陰痿不用。陽急則反折，陰急則俯不伸”。KOA正屬于經(jīng)筋病的范疇，膝部氣血不通，不通則痛，表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)局部軟組織疼痛、活動(dòng)受限。針刀療法通過松解周圍軟組織攣縮，從而調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)周邊肌肉力學(xué)的平衡，疏通膝部氣血，達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀之功[5,34，35]。

以上研究發(fā)現(xiàn)，針刀可以通過調(diào)節(jié)Ca2+釋放，使Calmodulin、Calpain表達(dá)減少，Calreticulin表達(dá)增多，并抑制Caspase家族的激活，減緩膝軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善膝關(guān)節(jié)軟骨退變的情況，達(dá)到治療KOA的目的。然而，細(xì)胞的凋亡途徑復(fù)雜，且多因素相互影響相互作用。本研究對(duì)于針刀調(diào)節(jié)Ca2+釋放的機(jī)制進(jìn)行了初步觀察但仍比較淺顯，還需要今后進(jìn)行更深層次的探討。