李麗雅，劉玉猛，張永，張新勝，楊雪艷，劉英華

(中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心營養(yǎng)科，北京 100853)

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活方式和飲食習慣發(fā)生了極大改變，全球肥胖人數(shù)逐年增加。超重和肥胖已經(jīng)發(fā)展到“流行病”的程度，成為危害全球健康的嚴重公共衛(wèi)生問題。肥胖是引起脂代謝紊亂的相關危險因素[1，2]，多數(shù)肥胖患者均存在脂代謝紊亂。而脂代謝紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素[3，4]，在相關疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。也有研究發(fā)現(xiàn)，慢性全身性炎癥與代謝性疾病有關，而肥胖是一類慢性低度炎癥反應[5，6]，嚴重威脅人類身心健康，給家庭和社會帶來了極大的經(jīng)濟負擔。

近年來，隨著腸道微生態(tài)學研究的發(fā)展以及測序和分析技術的進步，越來越多的研究表明，腸道菌群在肥胖的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基線腸道微生物群作為個體減肥軌跡的預測指標優(yōu)于其他因素。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila，AKK)在瘦個體中顯著富集[7]，且通過動物實驗證實AKK在改善肥胖大鼠糖脂代謝紊亂中發(fā)揮有益作用[8]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)[9]是乳糜微粒、極低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的重要組成部分，可調(diào)節(jié)膽固醇和脂蛋白代謝，其缺失和變異都會引起體內(nèi)代謝失常及功能紊亂，高脂飼料誘導的肥胖ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠短期內(nèi)即可出現(xiàn)脂代謝異常。本研究通過高脂飼料誘導ApoE-/-小鼠建立肥胖模型，觀察AKK對其血脂代謝及炎癥因子相關指標的影響，為肥胖的治療提供實驗依據(jù)，進而為動脈粥樣硬化相關疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J、ApoE-/-4周齡小鼠，平均體質(zhì)量為(15.25±0.85)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號SCXK京2019-0008。

1.2 飼料及AKK

1.2.1 高脂飼料 喂養(yǎng)H10045飼料，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。能量占比為脂肪45%、碳水化合物35%、蛋白質(zhì)20%。

1.2.2AKK為德國DSMZ原裝進口，由北京孚曼生物技術有限公司擴增并提供經(jīng)低溫離心后的高濃縮菌混懸液。

1.3 主要試劑及儀器

全自動生化分析儀(日立HITACHI-7100)；甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)檢測試劑盒(北京新創(chuàng)科興科技有限公司)；Rayto RT-6100酶標分析儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；白細胞介素-L(interleukin-1, IL-1)、IL-6、IL-8、IL-10、C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；萬分之一電子天平(FA-N，中國民僑公司)；臺式高速冷凍離心機(TGL-16，湘儀公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色儀(Pannoramic SCAN，匈牙利3DHistech公司)，染色圖像由武漢百仟度生物科技有限公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 肥胖模型建立 健康SPF級雄性C57BL/6J、ApoE-/-小鼠，均飼喂高脂飼料。小鼠飼養(yǎng)在溫度24℃、濕度75%、12h光照-黑暗循環(huán)的實驗室中，自由飲水，自由采食配好的飼料。觀察并記錄動物生長與進食情況。6周后稱量小鼠空腹體質(zhì)量，以C57BL/6J小鼠為對照組，體質(zhì)量超過對照組小鼠平均體質(zhì)量10%的ApoE-/-小鼠為肥胖建模成功。

1.4.2 動物分組 選取成功建模的ApoE-/-肥胖小鼠20只，按數(shù)字1～20隨機捉取進行編號，奇數(shù)為模型組，偶數(shù)為AKK干預組，每組各10只；對照組小鼠10只，共3組。

1.4.3 干預方法 對照組及模型組灌胃不含AKK的甘油制劑，AKK干預組灌胃含1×109CFUAKK的甘油制劑。每日灌胃1次，每次0.1 ml，共灌胃4周。

1.5 觀測指標

1.5.1 體質(zhì)量、附睪脂肪組織質(zhì)量及血液指標 干預結(jié)束后，小鼠禁食不禁水，12 h后測空腹體質(zhì)量。水合氯醛3 ml/kg麻醉后，腹主動脈采血，取附睪脂肪組織。用含促凝劑的真空采血管采血后，以1 600 g/min離心15 min，取上清液并按試劑盒操作說明書對血液指標進行測定。采用生化法測定TG、TC、HDL-C及LDL-C水平，Elisa法測定IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、CRP、TNF-α及MCP-1水平。用濾紙吸干附睪脂肪組織表面的組織液，用萬分之一電子天平稱重并記錄各組小鼠數(shù)據(jù)，計算其體脂百分比。體脂百分比=(附睪脂肪質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%。

1.5.2 HE染色 用福爾馬林溶液固定附睪脂肪組織,經(jīng)石蠟包埋切片后用HE染色。脫水封片后，用顯微鏡鏡檢采集圖像。將附睪脂肪組織HE染色切片于200倍顯微鏡下觀察脂肪細胞脂滴大小，每張切片隨機攝取10個視野，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析附睪脂肪細胞平均面積。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠空腹體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及體脂百分比的比較

3組小鼠初始空腹體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。喂養(yǎng)高脂飼料6周后，ApoE-/-小鼠空腹體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，建模成功。灌胃干預4周后，AKK干預組小鼠空腹體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及體脂百分比較模型組均有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表1)。

表1 3組小鼠空腹體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及體脂百分比的比較

Table 1 Comparison of fasting body mass, epididymal fat mass and body fat percentage among three groups of mice

表1 3組小鼠空腹體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量及體脂百分比的比較

Compared with control group,*P<0.05.

ItemControl groupModel groupIntervention group FP valueInitial fasting body mass(g)15.00±0.5815.33±0.87 15.38±1.06 0.4130.667Fasting body mass after 6 weeks of high fat diet(g)23.71±2.2927.33±2.00*26.25±2.05*5.9780.009Fasting body mass after 4 weeks of intervention(g)22.10±1.9526.73±1.60*25.26±1.89*13.2300.000Epididymal fat mass(g)0.25±0.040.34±0.14 0.31±0.70 1.6750.211Body fat percentage(%)1.12±0.131.25±0.48 1.24±0.30 0.3250.726

2.2 3組小鼠血脂代謝相關指標的比較

灌胃干預4周后，AKK干預組血脂代謝指標TG、TC及LDL-C顯著低于模型組，TG及LDL-C顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，AKK可逆轉(zhuǎn)APOE-/-導致的血脂異常的趨勢。AKK干預組HDL-C顯著高于模型組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05；表2)。

表2 3組小鼠血脂代謝相關指標的比較

2.3 3組小鼠炎癥因子相關指標的比較

灌胃干預4周后，AKK干預組炎性因子指標IL-1、IL-6、IL-8、CRP、TNF-α及MCP-1均顯著低于模型組及對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。IL-10有升高趨勢，但3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表3)。

表3 3組小鼠炎癥因子相關指標的比較

2.4 肥胖小鼠附睪脂肪組織HE染色結(jié)果

附睪脂肪組織HE染色切片于200倍顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠脂肪細胞排列緊密、界限清晰，單個視野下呈現(xiàn)出細胞直徑短、體積小、數(shù)量多的特點。與對照組比較，模型組小鼠脂肪細胞大小不均、形態(tài)不規(guī)則，呈大空泡狀，細胞壁變薄，單個視野下呈現(xiàn)出細胞直徑長、體積大、數(shù)量少的特點。而AKK干預組較模型組小鼠脂肪組織細胞大小明顯縮小，形態(tài)規(guī)整，單個視野下脂肪細胞數(shù)量明顯增多(圖1)。用Image Pro Plus 6.0軟件分析附睪脂肪細胞平均面積，結(jié)果顯示與對照組比較，模型組小鼠附睪脂肪組織細胞平均面積[(879.58±36.74)和(286.20±18.00)μm2]顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，AKK干預組小鼠附睪脂肪組織細胞平均面積[(330.45±55.84)和(879.58±36.74)μm2]顯著減小，差異均有統(tǒng)計意義(均P<0.05；圖2)。

圖1 3組小鼠附睪脂肪組織HE染色

圖2 3組小鼠附睪脂肪組織細胞平均面積比較

3 討 論

肥胖個體多數(shù)伴隨脂代謝紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)高脂飼料短期內(nèi)會出現(xiàn)脂代謝紊亂[9，10]。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠6周，設定按體質(zhì)量超過對照組小鼠平均體質(zhì)量10%的肥胖個體為實驗動物模型。從實驗結(jié)果分析，模型組血清血脂代謝指標及HE染色下脂肪組織細胞平均面積均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。反向證實，本研究設定成立。本課題組前期研究證實，1×109CFU/d濃度的AKK在改善肥胖大鼠糖脂代謝紊亂中發(fā)揮有益作用。故本研究將AKK的干預濃度定為1×109CFU/d，通過空腹體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、血脂代謝指標及血清中炎癥因子指標水平評價AKK對脂代謝紊亂的干預作用，為臨床深入研究AKK對脂代謝紊亂的作用機制提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，灌胃干預4周后，與模型組相比，1×109CFU/d濃度的AKK可降低ApoE-/-小鼠TG、TC及LDL-C水平，升高HDL-C水平(均P<0.05)，與Plovier等[11]的研究結(jié)果一致。AKK干預改善了肥胖ApoE-/-小鼠血脂代謝指標。此外，AKK干預組較模型組體質(zhì)量雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義?？赡苡捎贏KK干預時間短，體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯差異。

本研究結(jié)果顯示，1×109CFU/d濃度的AKK改善了高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖ApoE-/-小鼠的血清炎癥因子水平，與相關研究[12，13]結(jié)果一致，AKK對緩解宿主代謝炎癥具有積極作用。1993年，Hotamisligil等[14]于動物模型中首次發(fā)現(xiàn)肥胖與炎癥密切相關。隨著研究的進展，肥胖作為慢性炎癥性疾病的觀點被廣泛認可[15，16]。相關研究證實，肥胖患者脂肪組織增生會導致IL-1、IL-6、CRP、TNF-α及MCP-1等炎性因子的過度分泌和表達，緩解慢性炎癥已成為治療和預防肥胖及相關代謝性綜合征的新靶點[17，18]。近年來，有研究顯示，AKK有助于降低血清TNF-α、IL-8水平，增加IL-10的表達[19，20]。其可通過誘導T調(diào)節(jié)細胞減輕內(nèi)臟脂肪組織的炎癥[21]。AKK補充劑可減少肝臟和肌肉中的代謝性內(nèi)毒素血癥和炎癥信號傳導[22]。

本研究在200倍顯微鏡下觀察附睪脂肪組織HE染色切片，發(fā)現(xiàn)AKK干預組較模型組小鼠脂肪組織細胞大小縮小，形態(tài)規(guī)整；附睪脂肪組織細胞平均面積顯著減小(P<0.05)，表明AKK可改善體內(nèi)脂肪堆積。但是，AKK干預組及模型組，僅在附睪脂肪組織病理形態(tài)下呈現(xiàn)差異性，2組附睪脂肪質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義?？赡苡捎诒狙芯繕颖玖啃。讲G脂肪質(zhì)量未能出現(xiàn)差異性，今后有待進一步大樣本實驗對結(jié)果進行驗證。

綜上，本研究為肥胖的治療提供了進一步的實驗依據(jù)，為動脈粥樣硬化的防治提供新的治療思路。此外，本課題組對研究中小鼠的腸道菌群豐度、組織中炎癥因子的水平和表達也進行了相關測定，后續(xù)將進一步探討AKK對血脂代謝及炎癥因子的作用機制。隨著人們對AKK研究的不斷深入，相信不久的將來其會為超重與肥胖及肥胖代謝性疾病的預防及治療提供新的方向和選擇。