李峰，景洪江，李惠子，張新勝，徐慶，張永，薛長勇，劉英華*

(1空軍特色醫(yī)學(xué)中心臨床營養(yǎng)科，北京 100142 ；2火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心臨床營養(yǎng)科，北京 100088；3中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心臨床營養(yǎng)科，北京 100853)

隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會，預(yù)計到2030年阿爾茲海默癥(Alzheimer disease，AD)的人數(shù)將達(dá)到1 646萬，約占全球總病例數(shù)的1/4[1]，這將給家庭和社會帶來沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD的病理現(xiàn)象復(fù)雜、機(jī)制不清，但隨著人們不斷探究和認(rèn)識的深入，各種發(fā)病機(jī)制假說被相繼提出，最經(jīng)典的就是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)和Tau蛋白學(xué)說，這是因?yàn)榻馄蔄D患者大腦組織，發(fā)現(xiàn)普遍存在腦神經(jīng)細(xì)胞外大量Aβ沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)，以及Tau蛋白異常磷酸化形成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。目前臨床抗AD藥物僅能夠延緩病理癥狀的加重，并不能有效阻止、逆轉(zhuǎn)疾病過程，并且停藥后易復(fù)發(fā)，因此，對AD的有效預(yù)防才是關(guān)鍵。很多研究表明，膳食營養(yǎng)素特別是中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid，MCFA)在防治AD方面的作用不容忽視[2]。大腦是人體脂肪含量最豐富的器官，上世紀(jì)90年代初，Sparks等[3]就指出膽固醇可能是AD的危險因素，隨后有研究證實(shí)膽固醇確實(shí)能促進(jìn)Aβ沉積[4]。前期本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí)MCFA能夠改善C57BL/6J肥胖模型小鼠等實(shí)驗(yàn)對象的血脂水平[5,6]，也能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能[7]，人群試驗(yàn)顯示MCFA還能降低輕中度AD患者的認(rèn)知量表評分[8]。因此，本研究進(jìn)一步探討血脂和Aβ、Tau蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，為MCFA可能通過調(diào)節(jié)脂代謝來發(fā)揮改善AD的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將健康、12周齡的17只無特定病原體(specified pathogens free，SPF)級雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(APPSWe.PSEN1d9)按空腹體質(zhì)量隨機(jī)分為MCFA組(9只)和長鏈脂肪酸(long chain fatty acid，LCFA，8只)組，同窩陰性野生型(wide type，WT)小鼠(9只)作為WT組。實(shí)驗(yàn)動物許可證編號SCXK(滬)2017-0010，均由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。動物房溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%，12 h循環(huán)光照，干預(yù)期間每2天更換1次墊料和飲用水，并記錄小鼠飼料消耗量，每周稱量1次空腹體質(zhì)量(禁食不禁水12 h)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用脂肪酸來源及飼料配方 在普通大小鼠維持期飼料(AIN-96G)上，MCFA組和LCFA組分別添加了10%的MCFA和LCFA，并經(jīng)鈷60輻照射滅菌，各種干預(yù)用脂肪酸均由日清奧利友(中國)投資有限公司提供。各組飼料營養(yǎng)素含量基本一致，即蛋白質(zhì)占比約16.78%，脂肪占比約17.34%，碳水化合物占比約48.85%，含水量約8.80%，其他物質(zhì)含量約8.23%，各組飼料脂肪酸具體含量由北京市營養(yǎng)源研究所提供檢測報告(表1)。

表1 各組飼料脂肪酸含量

1.2.2 檢測指標(biāo) (1)血脂測定：小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥麻醉后處死，從腹主動脈取血后用臺式高速冷凍離心機(jī)TGL-16(湘儀公司)1 500×g離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyce-rides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。(2)大腦重量測定：剪開小鼠的頭皮，暴露出頭部，用直鑷將小鼠腦殼撥開，小心取出大腦組織，冰上放置，用梅特勒ME104E分析天平稱重，然后分離完整的皮層和海馬組織并稱量，所有組織用干凈的錫箔紙分別包裝，液氮保存后放于-80℃冰箱冷存?zhèn)錂z。(3)Western blot免疫印跡檢測：檢測指標(biāo)為大腦皮層和海馬組織的Aβ前體蛋白(Aβ precursor protein，APP)、Aβ和Tau蛋白，即按質(zhì)量與體積比1∶9加入1×細(xì)胞裂解液，并加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑，超聲破碎組織，離心取上清樣品進(jìn)行常規(guī)處理后，分別加入APP抗體(ab15272)、Aβ1-42抗體(ab201060)、Tau抗體(ab32057)，4℃過夜，然后依次漂洗、標(biāo)記并顯影，將顯色后的膜照相，采用scion image軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量和血脂情況比較

干預(yù)至36周齡后，MCFA組小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量和LDL-C明顯高于WT組(P<0.05)；LCFA組小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量和TC明顯高于WT組(P<0.05)。MCFA組與LCFA組小鼠空腹體質(zhì)量、大腦質(zhì)量、HDL-C和LDL-C比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而TC和TG比較，MCFA組明顯低于LCFA組(P<0.01；表2)。說明MCFA具有改善血脂的作用。

表2 MCFA和LCFA對小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量和血脂的影響

Table 2 Effect of MCFA and LCFA on blood fat, body and brain mass of mice

表2 MCFA和LCFA對小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量和血脂的影響

MCFA: medium chain fatty acid; LCFA: long chain fatty acid; WT: wild type; TC: total cholesterol; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; TG: triglycerides.Compared with WT group,*P<0.05;compared with MCFA group, #P<0.05.

GroupnInitial body mass(4-week,g)End body mass(36-week,g)Brain mass(g)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)WT914.82±1.9132.33±2.46 0.40±0.04 2.85±0.32 2.41±0.440.31±0.12 1.72±0.71 MCFA914.58±1.6838.00±3.96*0.45±0.02*3.17±0.29 2.88±0.220.50±0.15*1.36±0.28 LCFA814.14±1.4938.68±4.25*0.44±0.02*3.82±0.13*#2.90±0.710.47±0.17 2.44±0.77#

2.2 各組小鼠海馬、皮層組織APP、Aβ和Tau蛋白表達(dá)水平比較

MCFA組和LCFA組小鼠海馬和皮層組織APP、Aβ和Tau蛋白表達(dá)水平明顯高于WT組(P<0.05)；MCFA組小鼠海馬和皮層組織Aβ、Tau蛋白表達(dá)量明顯低于LCFA組(P<0.01)，皮層組織APP蛋白表達(dá)量也明顯低于LCFA組(P<0.05)，而海馬組織APP蛋白的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。各項(xiàng)指標(biāo)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)內(nèi)參值的面積灰度比值詳見表3，圖1。

圖1 各組小鼠大腦皮層和海馬Aβ、APP與Tau蛋白的表達(dá)

表3 各組小鼠海馬、皮層組織蛋白表達(dá)水平比較

Table 3 Protein expression levels of cerebral hippocampus and cortex in each group

表3 各組小鼠海馬、皮層組織蛋白表達(dá)水平比較

WT: wild type; MCFA: medium chain fatty acid; LCFA: long chain fatty acid; Aβ:β-amyloid; APP: Aβ precursor protein. Compared with WT group, *P<0.05；compared with MCFA group, #P<0.05.

GroupnCortexAPPAβTauHippocampusAPPAβTauWT90.61±0.220.23±0.050.35±0.130.43±0.090.38±0.040.49±0.10MCFA90.96±0.07*0.45±0.07*0.89±0.07*0.71±0.03*0.56±0.02*0.78±0.05*LCFA81.15±0.19*#0.88±0.04*#1.42±0.21*#0.76±0.09*0.68±0.03*#1.01±0.03*#

2.3 血脂與海馬、皮層組織Aβ、Tau蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

將MCFA組和LCFA組小鼠的TG、TC結(jié)果與其海馬、皮層組織的Aβ、Tau蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示TG與皮層組織Aβ蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.399；P<0.05)，而TC與皮層和海馬組織Aβ蛋白表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)(r=0.715，0.748；P<0.01)，也與海馬組織Tau蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.603；P<0.05)，說明小鼠血脂水平尤其是TC與Aβ之間具有顯著線性相關(guān)，可以較方便地預(yù)測腦組織Aβ蛋白的表達(dá)水平(圖2)。

圖2 TC和小鼠皮層、海馬組織Aβ表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

大腦含有豐富的脂質(zhì)，大多數(shù)膽固醇存在于髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞、質(zhì)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，髓鞘含有70%的脂質(zhì)，包括膽固醇、鞘脂和膽固醇磷脂。膽固醇、鞘脂是神經(jīng)元質(zhì)膜的基本成分，以脂閥的形式存在，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸發(fā)生和膜運(yùn)輸。Chew等[9]研究指出，膽固醇可以調(diào)節(jié)Aβ的代謝過程，如轉(zhuǎn)運(yùn)和清除等，即β-分泌酶1(β-site amyloid cleavage enzyme 1, BACE-1)和γ-分泌酶存在于神經(jīng)元質(zhì)膜的脂筏中，能促使APP裂解形成Aβ，而在AD中，增加的膽固醇脂筏聚集會增強(qiáng)BACE-1的作用，使Aβ產(chǎn)物增加，從而導(dǎo)致AD的病理特征SP的出現(xiàn)。此外，盡管大腦和血清中的膽固醇等脂類物質(zhì)因血腦屏障而各自獨(dú)立存在，但也有學(xué)者認(rèn)為[10]，高膽固醇血癥時會導(dǎo)致循環(huán)和腦中27-羥基膽固醇(27-hydroxycholesterol，27-OHC)均升高，27-OHC能通過血腦屏障，最終影響大腦膽固醇代謝和AD致病進(jìn)程的調(diào)節(jié)。Zhang等[11]研究顯示，27-OHC和LDL-C水平上升、HDL-C水平下降時，大腦Aβ的水平則上升。因此，膽固醇代謝異?？蓪?dǎo)致大腦脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。國內(nèi)外研究均已證實(shí)[12-14]，血清中TC、TG、LDL等水平與AD的發(fā)生密切相關(guān)，而部分學(xué)者則認(rèn)為只有TC與AD的發(fā)生有關(guān)聯(lián)[15]，與這些觀點(diǎn)并不完全一致的是，本研究僅發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠的血清TC水平與其皮層、海馬組織Aβ蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.715，0.748；P<0.01)，也與海馬組織Tau蛋白表達(dá)有明顯正相關(guān)(r=0.603；P<0.05)；而TG只與其皮層組織Aβ蛋白表達(dá)水平有相關(guān)性(r=0.399；P<0.05)，由此可以推測膽固醇代謝在AD的發(fā)生和進(jìn)展中可能占據(jù)更重要的位置，TC確實(shí)可以作為阿爾茨海默病早期診斷的生物標(biāo)志物[16]。

不同脂肪酸對于腦神經(jīng)組織和認(rèn)知功能的影響歷來是研究關(guān)注的熱點(diǎn)，MCFA具有明顯的生酮作用，很早引起人們的關(guān)注，主要源自其治療難治性小兒癲癇、脂質(zhì)吸收障礙等疾病有很好的療效[17]。近年來很多研究相繼證實(shí)，MCFA可以減少機(jī)體大腦Aβ沉積，改善AD患者認(rèn)知水平，是因?yàn)槠浯竽X神經(jīng)元獲取葡萄糖供能存在障礙，而MCFA生成的酮體是一種優(yōu)秀的替代性能源物質(zhì)[18]。一項(xiàng)納入152例AD患者的隨機(jī)對照雙盲的多中心試驗(yàn)，證實(shí)了一種中鏈甘油三酯產(chǎn)品AC1202能夠改善患者認(rèn)知功能，因此被FDA批準(zhǔn)用于輕至中度的AD代謝衰退過程的臨床營養(yǎng)治療中[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期的動物實(shí)驗(yàn)和人群試驗(yàn)均得到了與上述結(jié)果基本一致的結(jié)論，MCFA確實(shí)能改善AD動物或人群的認(rèn)知能力[7,8]。此外，長期攝入飽和脂肪酸或反式不飽和脂肪酸導(dǎo)致高膽固醇血癥等是誘發(fā)AD的危險因素，而MCFA則能通過增加糞便膽固醇排泄和轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出等機(jī)制，改善機(jī)體脂代謝，顯著改善機(jī)體的TC、TG、LDL-C等水平[5,6,20]。本研究也再次證實(shí)了MCFA改善TC、TG的作用，特別是相關(guān)性分析進(jìn)一步闡明了TC與小鼠大腦皮層、海馬組織Aβ蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，盡管兩者的因果關(guān)系尚未確定，但MCFA很可能通過調(diào)節(jié)脂代謝尤其是TC水平，從而降低AD小鼠大腦皮層和海馬組織Aβ沉積，改善認(rèn)知功能。

綜上，AD的病理機(jī)制十分復(fù)雜，MCFA具有抗氧化、生酮、調(diào)脂等多種作用，這與AD的病程進(jìn)展都有相關(guān)性，面對藥物有效防治AD手段欠缺和療效欠佳的現(xiàn)狀，通過調(diào)整MCFA等膳食營養(yǎng)素，來達(dá)到防治AD的目的，逐漸引起眾多學(xué)者的興趣和認(rèn)可。盡管MCFA通過調(diào)節(jié)脂代謝減少AD小鼠大腦皮層和海馬組織的Aβ沉積，從而改善其認(rèn)知功能的具體機(jī)制目前還不清楚，但其用于輔助防治AD具有獨(dú)特的潛能和優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用推廣。