★ 羅黎明 劉志勇（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

世界衛(wèi)生組織在2019年提出癌癥是導(dǎo)致人類死亡的第1或第2大因素，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的GLOBOCAN顯示，癌癥的診斷和治療受到新冠的影響，2021年全球估計(jì)有1 929萬例新癌癥病例和995.8萬例癌癥死亡［1-2］。以往研究癌癥的發(fā)生機(jī)制主要著眼于基因突變、缺失等DNA序列改變，從而導(dǎo)致癌基因和抑癌基因進(jìn)一步激活或者失活?？蒲泄ぷ髡咴诓粩嘌芯抗タ税┌Y的過程中，發(fā)現(xiàn)DNA序列的改變可癌癥的發(fā)生，非傳統(tǒng)遺傳的表觀遺傳調(diào)控也同樣在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文主要以表觀遺傳修飾之DNA甲基化為靶點(diǎn)，簡(jiǎn)單總結(jié)其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用和中藥抗腫瘤的去甲基化作用。

1 DNA甲基化

早在1983年，有研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，人類結(jié)腸癌細(xì)胞中特定基因的DNA甲基化減少。同年，另有研究報(bào)道癌細(xì)胞全基因組范圍的DNA甲基化中間產(chǎn)物5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）明顯降低［3］?，F(xiàn)階段研究者對(duì)表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制的了解仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)遺傳學(xué)，但DNA甲基化在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要性是毋庸置疑的。

DNA甲基化是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基可逆地添加到DNA序列中胞嘧啶的第五號(hào)位置的碳原子上面，形成5-甲基胞嘧啶的過程。見圖1。

圖1 DNA甲基化

人類基因組中近80%的CpG序列二核苷酸中可以檢測(cè)到DNA甲基化。癌癥中DNA甲基化異常指的是DNA過甲基化或低甲基化。DNA過甲基化指的是甲基的獲得，總是抑制轉(zhuǎn)錄和降低抑癌基因表達(dá)。而DNA低甲基化指的是DNA缺乏甲基化，影響基因組整體穩(wěn)定性或激活原癌基因。與DNA甲基化相關(guān)的酶有三類，分別具有建立、去除和識(shí)別DNA甲基化的功能，它們被形象地稱作“書寫者”“擦除者”和“讀取器”?！皶鴮懻摺笔荄NA甲基轉(zhuǎn)移酶，催化甲基添加到胞嘧啶殘基上，包括DNMT1/2、DNMT3A/B和DNMT3L等。“擦除者”是DNA 去甲基化酶，修飾并除去甲基，包括TET1/2/3等?！白x取器”是甲基識(shí)別相關(guān)的酶，識(shí)別并結(jié)合甲基最終影響基因表達(dá)，包括MeCP2、MBD1/2/4、UHRF蛋白，鋅指蛋白等。

2 DNA甲基化的建立與癌癥的關(guān)系

目前已知人類基因組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族包 括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L［4］。DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B能夠直接催化甲基加成到DNA上。DNMT1優(yōu)先甲基化半甲基化DNA，在DNA復(fù)制過程中定位于親代 DNA 鏈中的甲基化CpG 位點(diǎn)，與新合成的DNA鏈結(jié)合并使其甲基化，以精確模擬DNA復(fù)制前存在的原始甲基化模式［5］。此外，還具有修復(fù)脫氧核糖核酸甲基化的能力。因此，DNMT1被稱為“維持DNA甲基化酶”。DNMT3A和DNMT3B在結(jié)構(gòu)與功能上極為相似，與DNMT1不同，DNMT3A和DNMT3B不偏好半甲基化DNA，可以對(duì)未修飾的DNA建立新的甲基化，將非甲基化CpG轉(zhuǎn)化為甲基化的CpG，因此被稱為“從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶”［6］。DNMT2和DNMT3L是非典型家族成員，不具有胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。DNMT2是一種RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，它能特異性甲基化天冬氨酸38位胞嘧啶［7］。DNMT3L可作為 Dnmt3A重新啟動(dòng)甲基化的一般刺激因子，與DNMT3A結(jié)合形成異四聚體促進(jìn)DNA從頭甲基化，并通過與組蛋白去乙?；?相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制［8］。DNMT3C是一個(gè)新的DNA甲基化酶，通過在嚙齒動(dòng)物基因組中復(fù)制 Dnmt3B進(jìn)化而來，在雄性生殖系中特異性地促進(jìn)年輕反轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)子的甲基化，這種特殊的活性是小鼠生育所必需的［4］。

DNA甲基化建立和維持過程中DNMTs的參與是必不可少的，也因此成為癌癥治療和抗癌新藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞和組織中DNMT1表達(dá)過量。DNMT1的表達(dá)與前列腺癌前體病變以及預(yù)后復(fù)發(fā)標(biāo)志物GSTP1和APC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，GSTP1和APC在前列腺癌中高度甲基化［9］。這表明DNMT1在前列腺癌進(jìn)展過程中的關(guān)鍵基因甲基化和抑制中起作用。大約25%的人類髓系或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤包括急性髓細(xì)胞白血病和T細(xì)胞急性淋巴性白血?。?0］，存在DNMT3A突變。Yang L等［11］建立了一個(gè)DNMT3A損失模型，發(fā)現(xiàn)DNMT3A 缺失導(dǎo)致 DNA 甲基化降低，主要發(fā)生在小鼠和人類樣本的造血增強(qiáng)子區(qū)域。這些證據(jù)表明 DNMT3A 在血液疾病發(fā)展中起著重要作用。

3 DNA去甲基化與癌癥

“擦除者”是指能夠移除和修改DNA甲基化的酶，是將甲基化胞嘧啶通過不同途徑或方式轉(zhuǎn)化還原成未修飾胞嘧啶的過程。該過程目前存在主動(dòng)和被動(dòng)兩種方式。被動(dòng)去甲基化發(fā)生于DNA復(fù)制過程中，DNMT1功能被阻斷或者活性降低，甲基化維持功能減弱，5mC含量稀釋從而實(shí)現(xiàn)DNA被動(dòng)去甲基化。在DNA復(fù)制過程中，核因子首先粘附半甲基化DNA，阻斷了DNMT1功能，被粘附的DNA不能被完全甲基化，從而導(dǎo)致5mC減少［12］。另一方面，DNMT1及其輔助因子UHRF1組成的復(fù)合物無法識(shí)別含有5-羥基甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmc）、5-甲 酰 基 胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）或5-羧基胞嘧啶（5-carboxycytosine，5cac）的半修飾二核苷酸，新合成DNA鏈上的胞嘧啶不能繼續(xù)甲基化，最終導(dǎo)致5mC減少［13］。隨著DNA多次復(fù)制之后5mC的含量逐漸被稀釋降低，實(shí)現(xiàn)DNA的被動(dòng)去甲基化。

主動(dòng)去甲基化可以發(fā)生在分裂或非分裂細(xì)胞中，需要一系列酶促反應(yīng)例如通過雙加氧酶TETs酶的作用或堿基切除修復(fù)（base excision repair,BER）機(jī)制將已經(jīng)甲基化的胞嘧啶還原成未修飾的胞嘧啶。目前已知兩條DNA主動(dòng)去甲基化途徑，雙加氧TET-糖苷酶TDG途徑，胞嘧啶核苷脫氨酶AID或胞嘧啶脫氨酶APOBEC脫氨基作用。TET-TDG途徑主要功能酶TET酶雙加氧酶家族，家族成員TET1/2/3都能將5mC轉(zhuǎn)化成5-羥甲基胞嘧啶5hmC。TETs繼續(xù)將5hmC一步步氧化成5-甲酰胞嘧啶5fC和5-羧基胞嘧啶5caC，最后在胸腺嘧啶DNA糖苷酶TDG的作用下堿基切除修復(fù)最終將5mC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶［14］。AID/APOBEC作用于氨基，可以將5mC脫氨基轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，經(jīng)過G/T錯(cuò)配修復(fù)后，誘導(dǎo)堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）通路并在TDG作用下將胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶。或者5mC在TET作用下轉(zhuǎn)化為5hmC后，AID/APOBEC作用于5hmC脫氨基形成5-羥甲基尿嘧啶5hmU［15］，最后在TDG作用下堿基切除修復(fù)，將5hmU轉(zhuǎn)化成胞嘧啶。有研究提出5hmC上沒有AID/ APOBEC脫氨酶的作用靶點(diǎn)，APOBEC不能作用于已經(jīng)被TET氧化修飾的胞嘧啶堿基5hmC、5fC、5caC［16］。5mC可以在兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾：胺基和甲基。5mC的胺基可以通過AID/APOBEC脫胺，將5mC轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。5mC的甲基可以通過Tet酶介導(dǎo)的添加羥基來修飾，生成5hmC。5hmC也可以在兩個(gè)位置進(jìn)行化學(xué)修飾：胺基和羥甲基。AID/APOBEC可以脫氨5hmC，產(chǎn)生5hmU。5hmC的另一個(gè)化學(xué)途徑是Tet可以進(jìn)一步氧化5hmC形成5fC和5caC。最終，每個(gè)途徑的產(chǎn)物-Thy、5hmU、5fC和5caC-被識(shí)別并裂解，替換為由TDG或SMUG1介導(dǎo)的裸胞嘧啶。見圖2。

圖2 DNA去甲基化途徑

癌癥發(fā)生的標(biāo)志性事件之一是腫瘤抑制基因啟動(dòng)子處整體低甲基化和局部高甲基化。DNA甲基化可能會(huì)使基因失活,在多種癌細(xì)胞株，包括乳腺癌、鼻咽、食管癌、肺癌、宮頸癌和腎癌，以及淋巴瘤，都顯示出高頻率的TET1啟動(dòng)子甲基化和沉默。TET1催化結(jié)構(gòu)域的異位表達(dá)重新激活了沉默的腫瘤抑制基因（DLit2，ZNF382，HOXA9和DKK1），并顯著抑制了癌細(xì)胞的增殖［17］。另一項(xiàng)報(bào)道支持TET抑制腫瘤作用的研究是通過抑制α酮戊二酸脫氫酶增加氧化反應(yīng)中TET酶的輔助因子-酮戊二酸水平，在該研究中，α酮戊二酸增加了體內(nèi)高侵襲性轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型和細(xì)胞系中TET的活性，下游抗轉(zhuǎn)移微RNA（mir-200）家族表達(dá)的增加。而mir-200的升高導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺轉(zhuǎn)移下調(diào)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移從而達(dá)到抑癌作用［18］。這些發(fā)現(xiàn)佐證了TET1的腫瘤抑制作用。同時(shí)也有多方面的研究報(bào)道過TET 的致癌活性，包括TET1的表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，激活TNBC 中的 PI3K 致癌信號(hào)，影響卵巢上皮癌和三陰性乳腺癌中的細(xì)胞遷移、腫瘤干細(xì)胞致瘤性等［19］。TETs調(diào)控基因表達(dá)是多途徑多層次的，TETs是腫瘤抑制因子還是致癌基因取決于細(xì)胞環(huán)境、調(diào)節(jié)模式、不同的相互作用伙伴以及上游和下游信號(hào)通路。

4 DNA甲基化的識(shí)別與癌癥

“讀取器”是指能夠識(shí)別DNA甲基化的酶，主要有3個(gè)蛋白家族：MBD蛋白家族，UHRF蛋白，鋅指蛋白家族。MBD蛋白家族包括第一個(gè)確定的甲基結(jié)合蛋白MeCP2以及MBD1，MBD2，MBD3和MBD4［20］。家族成員都包含一個(gè)甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)我换蚨鄠€(gè)對(duì)稱甲基化CpG位點(diǎn)具有更高的親和力［21］。MeCP2含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域TRD，通過TRD與Dnmt1結(jié)合，并將Dnmt1招募到半甲基化DNA中進(jìn)行維持性甲基化［22］。MeCP2、MBD1、MBD2大部分是與組蛋白去乙酰化酶復(fù)合物相互作用從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄抑制的功能［23］。MBD3由于MBD結(jié)構(gòu)域的突變而不能直接與DNA結(jié)合［20］。MBD4正常情況下能夠與DNA結(jié)合，但它結(jié)構(gòu)域上含有T-G錯(cuò)配糖苷酶，優(yōu)先識(shí)別鳥嘌呤與尿嘧啶、胸腺嘧啶或5-氟尿嘧啶的錯(cuò)配，并結(jié)合參與錯(cuò)配修復(fù)的蛋白質(zhì)［24］。UHRF家族包括UHRF1和UHRF2，UHRF蛋白家族除了結(jié)合DNA而抑制轉(zhuǎn)錄以外，更重要的是，它們可以與DNMT1結(jié)合并靶向半甲基化的DNA鏈，尤其是在DNA的復(fù)制過程中起著維持DNA甲基化的作用［25］。最后是鋅指蛋白，包括Kaiso，ZBTB4和ZBTB38。Kaiso用3個(gè)鋅指基序來結(jié)合兩個(gè)連續(xù)甲基化的CpG，而ZBTB4和ZBTB38則可以結(jié)合單個(gè)甲基化的CpG位點(diǎn)［26］。與MDB蛋白家族類似，鋅指蛋白也可以抑制轉(zhuǎn)錄。比如，在人和老鼠的結(jié)腸癌中，Kaiso就是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，它與甲基化的CpG簇結(jié)合并抑制甲基化的抑癌基因的表達(dá)［27］。

5 中藥的抗腫瘤與去甲基化作用

以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)的中藥因其療效好且無嚴(yán)重副作用的優(yōu)點(diǎn)越來越多地被應(yīng)用于腫瘤治療中，作為輔助或者替代療法，有效地提高了患者生存率，改善了患者的生活質(zhì)量［28-29］。許多中藥植物化學(xué)物質(zhì)參與5-hmC 的形成和失活的DNA甲基化過程。廣泛存在于水果蔬菜等各種植物中的維生素C已被證明參與DNA羥甲基化過程，發(fā)揮抗腫瘤作用［30］。因此，推測(cè)中藥在癌癥治療中的一個(gè)重要功能是調(diào)控TET依賴的DNA去甲基化。逆轉(zhuǎn)腫瘤相關(guān)基因異常高甲基化，去甲基化恢復(fù)腫瘤抑制基因的表達(dá)成為抗腫瘤研究和新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。迄今為止，中藥與 DNA 去甲基化關(guān)系的研究還很有限。

在一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究中，經(jīng)薯蕷皂苷處理后的乳腺癌細(xì)胞TET2和TET3表達(dá)上調(diào)，TET1表達(dá)下調(diào)，并且對(duì)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移有抑制作用［31］。天花粉為清熱瀉火類藥物,主要用于治療熱病口渴、黃疸、肺燥咳血、癰腫等，近年來發(fā)現(xiàn)它的有效成分天花粉蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的脾酪氨酸激酶基因有明顯的去甲基化作用［32］，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa和Caski的APC基因也有去甲基化作用［33］。丹參具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等活性,在臨床上用于治療心腦血管疾病、癌癥以及各種炎癥，丹參酮ⅡA可通過下調(diào)肝癌細(xì)胞DNMT1，DNMT3a，DNMT3b的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化狀態(tài)，其抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與激活NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)Nrf2基因CpG島的去甲基化有關(guān)［34］。葡萄科、豆科、百合科、桃金娘科、蓼科等多種植物中的白藜蘆醇上調(diào)前列腺癌細(xì)胞LNCap、PC3和DU145中5hmC和TET1水平，下調(diào)5mC水平從而去甲基化TIMP2、TIMP3［35］基因，抑制腫瘤的遷移和侵襲。黃連中的小檗堿通過抑制DNMT1和DNMT3B表達(dá)逆轉(zhuǎn)甲基化基因TP53的甲基化狀態(tài)并增加表達(dá)，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266凋亡［36］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能增加tet3的表達(dá)并去甲基化mir-145，mir-145靶向HK2并抑制它的表達(dá)，從而拮抗卵巢癌細(xì)胞的瓦爾堡效應(yīng)［37］。當(dāng)歸主要功效是補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸主要活性成分Z-蒿本內(nèi)酯能使前列腺腫瘤中Nrf2啟動(dòng)子CpG島去甲基化,從而再激活Nrf2基因和Nrf2目的基因表達(dá)［38］。當(dāng)歸對(duì)肝癌細(xì)胞、白血病KG-1細(xì)胞系等癌細(xì)胞都有抑制增殖活性的作用［39-40］，但是否跟去甲基化有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

6 結(jié)語(yǔ)

中藥作為DNA去甲基化藥物治療腫瘤優(yōu)勢(shì)巨大，同時(shí)也有很多難點(diǎn)。中藥成分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞不容易對(duì)中藥產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)也很難確定其抗腫瘤有效成分，從而限制了中藥在臨床抗腫瘤治療中的應(yīng)用。中藥去甲基化的研究大部分是單一的化學(xué)成分，有關(guān)中藥復(fù)方的DNA去甲基化研究鮮有報(bào)道。中藥與DNA去甲基化關(guān)系的研究還很有限，主要是單一成分對(duì)腫瘤某一高甲基化抑癌基因，去甲基化重新激活該基因，從而達(dá)到抑癌作用或者干預(yù)DNA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)從而調(diào)控基因甲基化狀態(tài)。

癌癥是一類極其復(fù)雜的疑難雜癥，中藥作為DNA去甲基化藥物，應(yīng)進(jìn)一步研究中藥復(fù)方的抗腫瘤活性成分及活性組群，篩選出具有去甲基化作用的靶向成分，闡明其作用機(jī)制，提高其生物學(xué)效應(yīng)，擴(kuò)大其在臨床抗腫瘤治療中的應(yīng)用。