曾帆，王瀾，萬小勤，黃榮鳳，張志輝，李旻典

研究報告

瘦素基因啟動的新型脂肪細胞表達Cre工具小鼠的構(gòu)建

曾帆，王瀾，萬小勤，黃榮鳳，張志輝，李旻典

陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，代謝生物鐘與心血管病中心，重慶 400038

脂肪組織是發(fā)揮能量儲存與內(nèi)分泌功能的重要代謝組織。脂肪細胞的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)與病理生理功能是重要的研究方向?？臻g轉(zhuǎn)錄組學研究表明脂肪細胞至少存在3種不同亞型，其標記基因包括瘦素(leptin,)、脂聯(lián)素(adiponectin,)、圍脂滴蛋白(perilipin-1/4,)和血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A,)等。瘦素基因與脂聯(lián)素基因分別標記了不同亞型的脂肪細胞。目前通常用脂聯(lián)素基因Adipoq-Cre工具小鼠研究成熟脂肪細胞的生理功能，但缺乏瘦素基因啟動的Cre工具小鼠以追蹤LEP+亞型脂肪細胞的發(fā)育與穩(wěn)態(tài)。本研究通過CRISPR-Cas9技術編輯小鼠基因，形成Lep-P2A-Cre融合基因，其產(chǎn)物通過P2A肽的自剪切作用，解離為LEP與CRE蛋白，從而實現(xiàn)內(nèi)源基因啟動的Cre表達(Lep-Cre)。本研究通過tdTomato示蹤工具，分析Lep-Cre在不同脂肪組織與非脂肪組織的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lep-Cre在白色脂肪和米色脂肪組織中活性最強，其次是棕色脂肪，在下丘腦核團不表達，但在多個外周器官存在不同程度的活性。本研究構(gòu)建了瘦素基因啟動的Lep-Cre工具小鼠，為深入研究LEP+亞型脂肪細胞的發(fā)育與功能提供新工具。

瘦素；脂肪細胞；Cre-loxP；脂肪組織

脂肪組織不僅是一種能量儲存組織，也是一種重要的內(nèi)分泌組織，在維持能量穩(wěn)態(tài)和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用[1]。脂肪組織有3種不同類型，即白色、米色和棕色脂肪組織，其功能與作用不同[2]。白色脂肪組織主要功能是通過儲存和釋放脂質(zhì)調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)以及分泌脂肪因子(如脂聯(lián)素、抵抗素等)調(diào)節(jié)代謝[3]。米色和棕色是屬于產(chǎn)熱脂肪組織，其中米色脂肪組織是機體響應冷刺激后經(jīng)表型轉(zhuǎn)換獲得適應性產(chǎn)熱能力[4]。健康的脂肪組織能靈活地響應合成代謝和分解代謝信號以保持機體能量平衡，脂肪功能異常是糖尿病前期與肥胖的重要病理生理基礎[5]。

近年來，單細胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組學研究提示，脂肪組織可能存在至少3種不同亞型的成熟脂肪細胞[6]。針對小鼠脂肪組織的空間轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，這3種不同亞型的脂肪細胞在能量代謝、炎癥因子、特異性基因等方面存在差異，其標記基因包括瘦素(leptin,)、脂聯(lián)素(adiponectin,)、圍脂滴蛋白(perilipin-1/4,)和血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A,)[7]。LEP+脂肪細胞富集表達脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白、細胞間相互作用、瘦素分泌和鐵代謝等通路的基因；PLIN+細胞富集表達脂聯(lián)素和糖脂代謝基因；SAA+細胞富集表達視黃醇代謝相關基因[7]。采用單細胞核的測序研究也將脂肪細胞分為3種亞型，其中LEP標記的脂肪細胞與應激相關，在高脂誘導肥胖中更容易增加細胞體積[8]。針對成人的脂肪細胞單細胞測序結(jié)合熒光成像實驗表明LEP與ADIPOQ可以獨立標記不同的脂肪細胞，而且的表達與細胞脂肪含量沒有統(tǒng)計學相關性[9]。因此來自小鼠與人類的脂肪細胞單細胞研究中均發(fā)現(xiàn)LEP與ADIPOQ標記不同的脂肪細胞。

在目前的研究中，作為脂肪細胞的特異性基因，其啟動子驅(qū)動的Adipoq-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是研究脂肪細胞功能的最重要的工具鼠。為了將來進一步研究不同亞型的脂肪細胞功能提供Cre工具鼠，本研究選取與分屬不同亞型的基因用CRISPR-Cas9內(nèi)切酶系統(tǒng)構(gòu)建原位插入Cre序列的Lep-Cre工具小鼠。編碼的基因(NCBI參考序列：NM_008493.3)位于小鼠6號染色體上，含有3個外顯子，ATG起始密碼子在外顯子2，TGA終止密碼子在外顯子3。為了明確Lep-Cre的組織表達分布，本研究利用loxP-Stop-loxP (LSL)-tdTomato示蹤工具，追蹤Lep-Cre在不同脂肪組織與非脂肪組織或器官中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

B6J-Lepem1(Cre)Mdli(Lep-Cre)基因改造小鼠采用CRISPR/Cas9基因編輯技術構(gòu)建。首先根據(jù)CRISPOR數(shù)據(jù)庫(http://crispor.tefor.net/)設計針對基因的gRNA序列(5′-CTGAAGTTTCAAA-GGCCACC-3′)，繼而用基因編輯技術將小鼠基因序列重組形成“Lep-Peptide 2A (P2A)-Cre”序列。Lep-P2A-Cre序列刪除了位于基因外顯子3的編碼序列(CDS)末尾的TGA終止密碼子，并連接具有自水解斷裂特性的P2A序列與Cre序列(圖1)?！癓ep-P2A-Cre”序列由于的終止子被刪除，接上P2A的堿基序列，其翻譯產(chǎn)物在P2A作用下斷裂，形成合成C端帶上P2A的LEP蛋白和N端帶脯氨酸的CRE。Lep-Cre小鼠委托賽業(yè)生物(Cyagen)構(gòu)建。RosaLSL-tdTomato/+(LSL-tdTomtato)是在ROSA26位點插入一個loxP- Stop-loxP-tdTomato 元件框，loxP-Stop-loxP可以阻斷tdTomato的轉(zhuǎn)錄及表達，在表達CRE重組酶的細胞中l(wèi)oxP-Stop-loxP元件將被剪切，剪切后tdTomato將重新表達，tdTomato在波長為510～560 nm的激發(fā)光下顯示紅色熒光[10]。

通過內(nèi)切酶介導的突變技術在小鼠瘦素基因的編碼區(qū)序列后插入肽2A(P2A)與Cre重組酶()基因序列。gRNA: 向?qū)NA；3′-UTR：3′端非翻譯區(qū)。

1.2 B6J-Lepem1(Cre)Mdli/+; RosaLSL-tdTomato/+小鼠構(gòu)建

Lep-Creem/+與LSL-tdTomtatoTg/+雜交，選取后代Lep-Creem/+與LSL-tdTomtatoTg/+(Lep-Cre reporter)作為研究對象。對照組為6周齡雌性C57BL/6J小鼠購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。6周齡雌性實驗小鼠在12 h光照/12 h黑暗、24～26℃、40%～70%濕度條件下飼養(yǎng)。本研究動物實驗方案獲得陸軍軍醫(yī)大學倫理審查委員會批準，動物飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學高原軍事醫(yī)學系SPF級動物房。

1.3 DNA提取及基因分型鑒定

待鑒定的每只小鼠取尾部2 mm置于EP管中，每管添加蛋白酶K消化液(MK539480，美國Merck公司) 100 μL，將組織在56℃孵育過夜，過夜后在98℃孵育13 min，使蛋白酶變性，采用5000 ×離心15 min，取上清液用于PCR (引物序列見表1)?；蚍中筒捎?×Master Mix (P222，南京Vazyme公司)在退火溫度為60℃下擴增35個循環(huán)，擴增產(chǎn)物用于DNA凝膠鑒定。

1.4 組織切片及熒光觀察

Lep-reporter小鼠用1%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉后取下丘腦室旁核(the paraventricular nucleus of the hypothalamus)、肝臟、腓腸肌、腎臟、心臟、腹股溝皮下脂肪(簡稱皮下脂肪)、性腺脂肪、腸系膜脂肪、肩胛間棕色脂肪、腎周脂肪。取下的組織浸泡在4℃的4%多聚甲醛中過夜，過夜后組織在新鮮PBS洗滌3次后，換新鮮PBS在4℃中過夜，取出組織浸泡在PBS-15%蔗糖溶液中4℃過夜。組織預處理后，用濾紙吸干組織表面水分，OCT膠(4583，日本SAKURA公司)包埋組織，白色脂肪在–45℃條件下進行切片，切片厚度30 μm，其余組織在–20℃進行切片，棕色脂肪切片厚度12 μm，其他組織切片厚度6 μm。組織切片在4%多聚甲醛中浸泡5 min，PBS洗滌3次，甩干，然后進行DAPI (C1005，上海碧云天生物技術有限公司)染色，脂肪組織和室旁核染色10 min，其他組織染色5 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅封片劑(AR1109，武漢博士德公司)，熒光顯微鏡(NI-U，日本Nikon公司)采用510～560 nm的激發(fā)光，曝光150 ms進行圖片采集。

表1 基因分型引物

F：上游引物(forward primer)；R：下游引物(reverse primer)；WT：野生型；Tg：基因改造型。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lep-reporter小鼠構(gòu)建結(jié)果

為了明確Cre重組酶在小鼠基因啟動子調(diào)節(jié)下表達，采用了3只Lep-Creem/+小鼠與5只LSL- tdTomatoTg/+小鼠進行雜交繁殖(圖2A)。利用PCR與DNA電泳對50只子代小鼠的尾部組織提取的基因組DNA開展基因型分析，獲得4只攜帶Cre與tdTomato的雜合子小鼠(Lep-Creem/+; LSL-tdTomatoTg/+)，即Lep-reporter小鼠。以其中的3只Lep-reporter小鼠為例，圖2B和C分別表明42#、45#和49#這3只小鼠攜帶413 bp的Cre特征片段和200 bp的tdTomato特征片段。這3只小鼠同時也表達300 bp的野生型DNA特征片段(圖2C)，表明這些小鼠是攜帶tdTomtato的雜合子小鼠。

圖2 Lep-reporter雜交小鼠基因分型鑒定

A：Lep-reporter繁殖示意圖。B：PCR分析檢測Lep-Cre特征DNA片段。DNA凝膠只有413 bp 條帶的為Lep-Cre，無條帶的為WT。C：PCR分析檢測LSL-tdTomato特征DNA片段。DNA凝膠只有200 bp 條帶的為LSL-tdTomato 純合子，同時有200 bp和300 bp 條帶的為LSL-tdTomato 雜合子，只有300 bp條帶的為WT。Lep-reporter小鼠為同時具有Lep-Cre和LSL-tdTomato，編號為42#、45#和49#的小鼠符合實驗要求，即為Lep-reporter小鼠。M：DNA Marker；WT：野生型；em：核酸內(nèi)切酶介導的突變。

2.2 Lep在小鼠脂肪組織中的表達情況

對4只Lep-reporter小鼠與1只WT小鼠進行免疫熒光顯微成像分析，以明確Lep-Cre在不同類型和解剖部位的脂肪組織的表達活性。分別解剖與固定2個解剖部位的白色脂肪組織(性腺脂肪、腸系膜脂肪)、米色脂肪組織(皮下脂肪)和2個解剖部位的棕色脂肪組織(腎周脂肪和肩胛間棕色脂肪)。結(jié)果顯示，Lep-Cre的信號在性腺脂肪、皮下脂肪和腸系膜脂肪大量存在，但在腎周脂肪和肩胛間棕色脂肪以中等偏高且明顯高于WT組信號強度存在(圖3)。這表明Lep-Cre在白色脂肪與米色脂肪大量表達，在棕色脂肪以中等偏高的程度表達，但這些脂肪組織的Lep-Cre均發(fā)揮切割loxP序列的功能。

2.3 Lep在其他組織器官中的表達情況

為探明Lep-Cre是否在非脂肪細胞表達，在采集脂肪組織數(shù)據(jù)的同時，針對5種不屬于脂肪組織的器官(下丘腦室旁核、心臟、腓腸肌、肝臟、腎臟)開展熒光顯微成像。結(jié)果表明，Lep-Cre產(chǎn)生的tdTomato熒光信號在肝臟大量存在，幾乎在視野中所有的肝細胞中檢測出；但未在下丘腦室旁核組織檢測出(圖4)。熒光信號在其他外周組織如腎臟、肌肉與心臟的強度較低，并且不是所有細胞都檢測到信號。因此，Lep-Cre在多種外周組織的非脂肪細胞表達，尤其是在肝細胞大量表達，但未在下丘腦室旁核組織表達。

圖3 Lep-Cre在小鼠脂肪組織中的表達活性

WT：野生型對照；tdTomato 標記顯示為紅色；DAPI 染細胞核，顯示為藍色；標尺：200 μm。

3 討論

本研究通過CRISPR-Cas9編輯小鼠瘦素基因，在不破壞原基因編碼區(qū)序列的情況下，引入Cre重組酶，從而實現(xiàn)內(nèi)源瘦素基因順式調(diào)節(jié)元件驅(qū)動的Cre表達。借助LSL-tdTomato工具鼠與免疫熒光成像分析，本研究發(fā)現(xiàn)這種Lep-Cre工具鼠在至少兩處白色脂肪組織和一處米色脂肪組織中Cre活性最強，其次是在兩處棕色脂肪組織，這符合旨在實現(xiàn)追蹤LEP+脂肪細胞的研究目的。Lep-Cre在不同脂肪組織的活性與基因表達的特點一致，例如在棕色脂肪組織中的表達受環(huán)境溫度影響，熱中性的環(huán)境溫度誘導棕色脂肪組織高表達，室溫抑制在棕色脂肪表達[11]。然而，Lep-Cre在肝臟、腎臟和心臟有非特異性表達，尤其是肝臟；室旁核中無活性，這些泄漏表達可能限制Lep-Cre在生理學或代謝生物學的應用。

目前作為脂肪細胞特異性Cre的工具鼠有aP2-Cre和Adipoq-Cre。脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，AFABP，F(xiàn)ABP4或aP2)是脂肪細胞表達量最高的幾個蛋白之一[12]，因此成為第一代脂肪細胞特異性表達Cre (aP2-Cre)工具鼠的靶向基因[13]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，aP2-Cre不僅在成熟脂肪細胞中表達，也內(nèi)皮細胞和脂肪組織基質(zhì)血管細胞驅(qū)動loxP位點的同源重組[14]。此外，aP2-Cre 可導致約2%的精子中 loxP位點發(fā)生重組[15]。脂聯(lián)素基因調(diào)控元件構(gòu)建的Cre工具鼠(Adipoq-Cre)較aP2-Cre對成熟脂肪細胞具有更高的選擇性，在目前已報道的其他組織中未顯示出重組活性[16]。Adipoq-Cre作為脂肪組織特異性Cre工具小鼠具有明顯的優(yōu)點，但目前廣泛使用的Adipoq-Cre工具鼠的Cre序列插入在基因的外顯子6和7之間，存在影響胚胎發(fā)育的風險[17]。是胚胎發(fā)育的關鍵基因，在該位點插入Cre潛在影響了的功能；這可能是Adipoq-Cre純合子出生較少的原因。

圖4 Lep-Cre在部分非脂肪組織的表達活性

WT：野生型對照；tdTomato 標記顯示為紅色；DAPI 染細胞核，顯示為藍色；標尺：200 μm。

作為一種新型的脂肪細胞標記基因，在白色和米色脂肪組織中大量表達[18]。本研究表明，Lep-Cre活性主要在白色和米色脂肪組織中，與報道的脂肪組織中活性一致，可以用于追蹤脂肪組織中LEP+脂肪細胞。盡管很多文獻報道了LEP與ADIPOQ標記不同的脂肪細胞[7～9]，最近的一篇針對小鼠與成人的脂肪組織的大型單細胞研究沒有報道該現(xiàn)象[19]。在本研究中也沒有觀察到完全不表達的脂肪細胞，這可能是由于組織切片方法限制了分析所有脂肪細胞的LEP蛋白水平，而且不同發(fā)育階段和解剖部位的脂肪組織可能存在LEP+與LEP-亞型脂肪細胞的比例差異。該問題可以通過采用更全面的小鼠模型結(jié)合流式細胞分析或單細胞測序解決?；谝陨辖Y(jié)果，本研究成功構(gòu)建了一種新型的脂肪細胞表達的Lep-Cre工具小鼠，為進一步研究LEP+脂肪細胞在不同脂肪組織的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)與代謝功能提供了工具。

[1] Cypess AM. Reassessing human adipose tissue., 2022, 386(8): 768–779.

[2] Zhang F, Hao GY, Shao ML, Nham K, An Y, Wang Q, Zhu Y, Kusminski CM, Hassan G, Gupta RK, Zhai QW, Sun XK, Scherer PE, Oz OK. An adipose tissue atlas: an image-guided identification of human-like BAT and beige depots in rodents., 2018, 27(1): 252–262.e3.

[3] Zhang ZH, Xin HR, Li MD. Circadian rhythm of lipid metabolism in health and disease., 2020, 4(7): 1900601.

[4] Cohen P, Kajimura S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat., 2021, 22(6): 393–409.

[5] Sakers A, De Siqueira MK, Seale P, Villanueva CJ. Adipose- tissue plasticity in health and disease., 2022, 185(3): 419–446.

[6] Lee KY, Luong Q, Sharma R, Dreyfuss JM, Ussar S, Kahn CR. Developmental and functional heterogeneity of white adipocytes within a single fat depot., 2019, 38(3): e99291.

[7] B?ckdahl J, Franzén L, Massier L, Li Q, Jalkanen J, Gao H, Andersson A, Bhalla N, Thorell A, Rydén M, St?hl PL, Mejhert N. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin., 2021, 33(9): 1869–1882.e6.

[8] Sárvári AK, Van Hauwaert EL, Markussen LK, Gammelmark E, Marcher AB, Ebbesen MF, Nielsen R, Brewer JR, Madsen JGS, Mandrup S. Plasticity of epididymal adipose tissue in response to diet-Induced obesity at single-nucleus resolution., 2021, 33(2): 437–453.e5.

[9] Min SY, Desai A, Yang Z, Sharma A, DeSouza T, Genga RMJ, Kucukural A, Lifshitz LM, Nielsen S, Scheele C, Maehr R, Garber M, Corvera S. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells., 2019, 116(36): 17970–17979.

[10] Madisen L, Zwingman TA, Sunkin SM, Oh SW, Zariwala HA, Gu H, Ng LL, Palmiter RD, Hawrylycz MJ, Jones AR, Lein ES, Zeng HK. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain., 2010, 13(1): 133–140.

[11] Cancello R, Zingaretti MC, Sarzani R, Ricquier D, Cinti S. Leptin and UCP1 genes are reciprocally regulated in brown adipose tissue., 1998, 139(11): 4747–4750.

[12] Charles KN, Li MD, Engin F, Arruda AP, Inouye K, Hotamisligil GS. Uncoupling of metabolic health from longevity through genetic alteration of adipose tissue lipid-binding proteins., 2017, 21(2): 393–402.

[13] Barlow C, Schroeder M, Lekstrom-Himes J, Kylefjord H, Deng CX, Wynshaw-Boris A, Spiegelman BM, Xanthopoulos KG. Targeted expression of Cre recombinase to adipose tissue of transgenic mice directs adipose-specific excision of loxP-flanked gene segments., 1997, 25(12): 2543–2545.

[14] Shan TZ, Liu WY, Kuang SH. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues., 2013, 27(1): 277–287.

[15] Lee KY, Russell SJ, Ussar S, Boucher J, Vernochet C, Mori MA, Smyth G, Rourk M, Cederquist C, Rosen ED, Kahn BB, Kahn CR. Lessons on conditional gene targeting in mouse adipose tissue., 2013, 62(3): 864–874.

[16] Straub LG, Scherer PE. Metabolic messengers: adiponectin., 2019, 1(3): 334–339.

[17] Wong AM, Patel TP, Altman EK, Tugarinov N, Trivellin G, Yanovski JA. Characterization of the adiponectin promoter + Cre recombinase insertion in the Tg(Adipoq-cre)1Evdr mouse by targeted locus amplification and droplet digital PCR., 2021, 10(1): 21–27.

[18] Pereira S, Cline DL, Glavas MM, Covey SD, Kieffer TJ. Tissue-specific effects of leptin on glucose and lipid metabolism., 2021, 42(1): 1–28.

[19] Emont MP, Jacobs C, Essene AL, Pant D, Tenen D, Colleluori G, Di Vincenzo A, J?rgensen AM, Dashti H, Stefek A, McGonagle E, Strobel S, Laber S, Agrawal S, Westcott GP, Kar A, Veregge ML, Gulko A, Srinivasan H, Kramer Z, De Filippis E, Merkel E, Ducie J, Boyd CG, Gourash W, Courcoulas A, Lin SJ, Lee BT, Morris D, Tobias A, Khera AV, Claussnitzer M, Pers TH, Giordano A, Ashenberg O, Regev A, Tsai LT, Rosen ED. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue., 2022, 603(7903): 926–933.

Targeting leptin-positive adipocytes by expressing the Cre recombinase transgene under the endogenous leptin gene

Fan Zeng, Lan Wang, Xiaoqin Wan, Rongfeng Huang, Zhihui Zhang, Min-Dian Li

Adipose tissue plays an important role in metabolic physiology through energy storage and endocrine functions. Spatial transcriptomics is revealing the complexity of cell types and their interaction in the adipose tissue with regards to development, homeostasis and disease. Emerging evidence suggests the existence of different subtypes of mature adipocytes that may have distinct functions, the markers of which include leptin (), adiponectin (), perilipin-1/4 (), and serum amyloid A (), marking different adipocyte subtypes. Currently, Adipoq-Cre is widely used to study adipocyte biology, however, there is no Cre line that specifically targets LEP+adipocytes. Here, we report the construction and validation of a Lep-Cre mouse line, which has the endogenousgene edited by the CRISPR-Cas9 technology to generate the Lep-peptide 2A (P2A)-Cre fusion gene. P2A induces an auto-hydrolysis of the fusion protein, leading to expression of the Cre recombinase by thegene activity. The activity of Lep-Cre in different depots of adipose tissues and non-adipose tissues was visualized by the immunofluorescence microscopy in the Lep-Cre Rosa26-loxP-Stop-loxP-tdTomato mice. We showed that Lep-Cre marked white/beige adipose depots extensively, followed by brown adipose depots. Leaky activity was observed in varying degrees among peripheral organs but not in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. In summary, we have constructed a new adipocyte-targeting Cre mouse line that would be useful to study the development and physiology of LEP+adipocytes.

leptin; adipocyte; Cre-loxP; adipose tissue

2022-07-15;

2022-09-02;

2022-09-13

國家自然科學基金青年科學基金項目(編號：81900776)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81900776)]

曾帆，碩士，研究實習員，研究方向：代謝生物鐘與心血管疾病。E-mail: zengf719@163.com

李旻典，博士，研究員，研究方向：代謝生物鐘與心血管疾病。E-mail: mindianli@tmmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-236

(責任編委: 孟卓賢)