王紅麗

（東明縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，山東 菏澤 274500）

當(dāng)食品受到人畜糞便污染后，其中就會(huì)出現(xiàn)大腸菌群，這使得大腸菌群成為了營養(yǎng)與食品衛(wèi)生檢測(cè)的主要指標(biāo)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法雖具有較高的準(zhǔn)確度，但其檢測(cè)速度慢，在實(shí)際應(yīng)用中存在極大的限制，而MPN快速檢測(cè)法，則能快速完成檢測(cè)。因此，需要對(duì)此方法進(jìn)行深入分析，探討該快速檢測(cè)技術(shù)使用性能狀態(tài)，以推動(dòng)此檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，增強(qiáng)營養(yǎng)與食品衛(wèi)生檢測(cè)工作效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 此次MPN快速檢測(cè)試驗(yàn)所用的材料包括，試驗(yàn)用樣品、試驗(yàn)工具、培養(yǎng)基與試劑。此次試驗(yàn)所用的樣本為：由2021年9月采集的飲用水、飲料、白糖、軟糖、餅干、蜂蜜、果凍7種食品，制作出的381份試液樣本。試驗(yàn)所用的工具包括：均質(zhì)器、培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡、恒溫水浴鍋、天平，及滅菌的乳缽、培養(yǎng)皿、試管、玻璃珠、錐形瓶、吸管等。所用的培養(yǎng)基與試劑包括：EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、磷酸鹽緩沖液、革蘭氏染色液。

1.2 方法 MPN法檢測(cè)中，借助大腸菌群在37℃下發(fā)酵24h，就會(huì)產(chǎn)生酸氣、形成乳糖的原理，可先將食品樣品放在培養(yǎng)基中，置入37℃的環(huán)境下發(fā)酵24h，如未產(chǎn)生酸氣，說明食品合格，若產(chǎn)生酸氣，則進(jìn)行重發(fā)酵試驗(yàn)，并將樣品劃線接種在平板上，繼續(xù)放置在37℃的條件下，發(fā)酵24h，通過觀察菌落形態(tài)、革蘭染色情況，來驗(yàn)證是否存在大腸菌落。具體的試驗(yàn)方法為（1）以無菌操作的方式，將食品樣品放入盛有稀釋液的滅菌乳缽中，并在其中加入玻璃珠，搖晃滅菌乳缽，使玻璃珠運(yùn)動(dòng)將食品進(jìn)行研磨，制備出1∶10的食品稀釋液，再將該稀釋液放入均質(zhì)器中處理60s。（2）取出1mL的稀釋液，用吸管將其稀釋成為1∶100的稀釋液，再取1mL的1∶100稀釋液，繼續(xù)稀釋10倍，由此得到多種濃度的稀釋液，根據(jù)現(xiàn)行的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，選出三種稀釋液為試驗(yàn)用試液。（3）將乳糖膽鹽發(fā)酵管作為培養(yǎng)基，接種試液，再將接種了試液的培養(yǎng)基，放入37℃的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。待24h之后，將培養(yǎng)基取出，觀察產(chǎn)氣情況。若樣本產(chǎn)氣，則需將產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的樣本，劃線接種在瓊脂平板上，進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。（4）在發(fā)酵24h后，用顯微鏡觀察菌落形態(tài)，對(duì)1～2個(gè)疑似大腸菌群的菌落，予以革蘭氏染色處理，并將顯示為陰性無芽孢桿菌的菌落的一部分，接種到乳糖發(fā)酵管中，再次進(jìn)行發(fā)酵，待24h后，如發(fā)酵后產(chǎn)氣，則說明該菌群為大腸菌群。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證快速檢測(cè)法的準(zhǔn)確性，還通過對(duì)不產(chǎn)氣的樣本進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，來驗(yàn)證快速檢測(cè)技術(shù)，大腸菌群陰性結(jié)果的可靠性[1]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在快速檢測(cè)技術(shù)的研究中，研究者對(duì)檢測(cè)技術(shù)的精密度進(jìn)行了分析。在方法精密度評(píng)價(jià)中，研究者在每種食品對(duì)應(yīng)的樣本中，分別選擇1個(gè)樣本，對(duì)該樣本進(jìn)行10次的重復(fù)測(cè)定，再計(jì)算出測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，將該標(biāo)準(zhǔn)差作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算公式為（%）=S/x×100，RSD為標(biāo)準(zhǔn)差偏差、x為算數(shù)平均值、n為10、Xi為10次重復(fù)測(cè)定中的第i個(gè)值、S為標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 試驗(yàn)注意事項(xiàng) 上述發(fā)酵試驗(yàn)、培養(yǎng)基培養(yǎng)，及革蘭染色等試驗(yàn)操作手法，均存在對(duì)應(yīng)的操作規(guī)程、標(biāo)準(zhǔn)，因此，為保證結(jié)果的可靠性，須嚴(yán)格按照現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)程進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)操作，減少人為因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，為此研究工作提供良好的條件[2]。

2 結(jié)果

經(jīng)過上述操作，MPN大腸菌落快速檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果顯示，381份樣本中首次發(fā)酵檢測(cè)顯示不產(chǎn)氣、合格的樣本為330份。這330份樣本待第一次發(fā)酵呈現(xiàn)出不產(chǎn)氣結(jié)果后，研究者又對(duì)其進(jìn)行了重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，而重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與第一次發(fā)酵檢測(cè)的結(jié)果完全相同。在快速檢測(cè)中，首次發(fā)酵產(chǎn)氣的樣本有51份，經(jīng)過重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)后，其中有16份樣本的檢測(cè)結(jié)果為大腸菌群陰性。此外，研究者對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)的精確度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，所有食物樣本的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜8%。

上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與第一次發(fā)酵檢測(cè)的結(jié)果完全相同，這說明快速檢測(cè)法，能快速、精準(zhǔn)地識(shí)別大腸菌群陰性的食品樣本，有助于加快合格食品投入市場(chǎng)銷售的效率，對(duì)于易腐敗食品的營養(yǎng)、衛(wèi)生檢測(cè)水平的發(fā)展具有重要的意義。而根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，381份樣本中，僅有16份樣本的檢測(cè)結(jié)果與首次發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果存在差異，可見，首次檢測(cè)與復(fù)測(cè)存在差異的樣本數(shù)量占總樣本數(shù)據(jù)量的4.2%，即首次發(fā)酵檢測(cè)的準(zhǔn)確率可達(dá)到95.8%。因此，可以認(rèn)為此快速檢測(cè)技術(shù)具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確度。根據(jù)上述的精確度評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，MPN快速檢測(cè)法具有良好的精確度，在營養(yǎng)和食品衛(wèi)生檢測(cè)中具備較強(qiáng)的可靠性[3]。

3 討論

在上述試驗(yàn)中，所選用的乳糖膽鹽發(fā)酵法的作用原理是，利用大腸菌落分解該物質(zhì)所形成的乳糖，可讓伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生黑色的化合物，使得大腸菌落顯色，由此工作者即可通過觀察菌落顯色情況，判斷食品中是否存在大腸菌落。在此背景下，工作者對(duì)菌落形態(tài)、色澤的熟悉程度，會(huì)直接影響大腸菌落的檢出率，為了預(yù)防假陰性情況的出現(xiàn)，在實(shí)際操作中，需選取多個(gè)菌落，尤其是在未能有效發(fā)現(xiàn)疑似大腸菌落的情況下，而不能僅選取一個(gè)，以免受概率條件影響，導(dǎo)致所選菌落不典型，造成假陰性的檢測(cè)結(jié)果。但這種操作方法，通常會(huì)為工作者帶來更大的工作負(fù)擔(dān)。因此，熟練識(shí)別大腸菌群，對(duì)于快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)具有重要的意義[4]。大多數(shù)情況下，產(chǎn)氣量越大，檢出率也越大，但這種規(guī)律也會(huì)受樣品之間的種類差異所影響，并可能會(huì)出現(xiàn)米粒大小酸氣氣泡的情況下，依然會(huì)出現(xiàn)陽性檢測(cè)結(jié)果，在檢測(cè)操作中，不能完全依靠主觀經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷。而且部分酸氣氣泡所在位置比較隱蔽，難以用肉眼察覺，對(duì)于未產(chǎn)生氣體的樣本，需輕輕搖動(dòng)試管，讓隱藏的氣泡顯現(xiàn)出來，此時(shí)，若浮起氣泡，則應(yīng)當(dāng)視為有氣體產(chǎn)生，并進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵試驗(yàn)。通常來說，搖晃后有氣泡的樣本在后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)中的檢出幾率可達(dá)到50%以上。基于此，在具體的試驗(yàn)操作中，務(wù)必要注意上述幾點(diǎn)，以保證試驗(yàn)操作效果，增強(qiáng)大腸菌群快速檢測(cè)結(jié)果的可靠性[5]。

綜上，將大腸菌群快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到食品檢測(cè)中，能提升食品衛(wèi)生安全建設(shè)水平。經(jīng)過上述研究，可了解到，快速檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，但其誤差相對(duì)較小，而且能通過優(yōu)化技術(shù)操作來加以規(guī)避。因此，將快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到營養(yǎng)與食品衛(wèi)生檢測(cè)中，能提高檢測(cè)工作效率，為食品消費(fèi)者的健康安全提供保障。