莫國臻 黃關璇 石宇昕 吳秀芹 曹傳輝

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院,廣州,510280)

肝癌是一種發(fā)生在肝臟的惡性腫瘤,其發(fā)病率較高,致死人數(shù)較多。據(jù)相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明,世界上每年約60萬人患肝癌,在我國,患有肝癌的人數(shù)占全世界的50%之多[1-2]。早期肝癌患者無明顯的癥狀,患者在檢查時多為中晚期,因此導致肝癌晚期患者在5年內(nèi)的生存率僅有5%[3-4]。對于癌癥的治療,我國目前主要以手術以及化療為主,但化療的耐藥性較強,使得患者在的預后達不到理想目標。近年來,中藥在臨床上對于治療肝癌具有一定的優(yōu)勢,中藥中下瘀血湯最早用于婦女產(chǎn)后瘀血等,根據(jù)近年來的實驗研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯可抗肝纖維化、防治肝硬化[5-6]。下瘀血湯由生大黃、桃仁、土鱉蟲等多為中藥組成,周岱翰教授運用下瘀血湯治療肝癌積累了豐富經(jīng)驗[7]。Nanog(胚胎干細胞轉錄因子)是一種與干細胞特性相關的轉錄因子,近年來研究表明,癌細胞中的干細胞樣特性(為高表達干細胞相關基因特征)與腫瘤的惡性發(fā)展及預后聯(lián)系密切,因此Nanog在腫瘤中的作用引起了醫(yī)學界的重視[8-9]。至今,在前列腺癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)Nanog的表達異常,在肺癌細胞體內(nèi)成瘤的過程中也發(fā)現(xiàn)Nanog的異常表達[10-11],但對于癌細胞活性的具體作用機制目前為止尚不明確,因此本研究探討下瘀血湯對肝癌細胞的作用及對Nanog的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取10只6～8周齡健康SD大鼠,雄性,體質量(0.12±0.02)kg,購自上海西唐生物公司(動物合格證號:粵檢證字第95A08號)。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水,飼養(yǎng)1周后進行實驗。人肝癌細胞HepG2來自廣州吉妮歐公司,置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,待細胞完全貼壁后,更換培養(yǎng)液(10%胎牛血清杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)),待細胞融合度到80%～90%時,傳代,吸棄培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗3次,胰蛋白酶(0.25%)消化,完全培養(yǎng)基中斷。將剩余貼壁細胞吹打脫落,收集細胞懸液至離心管中(15 mL)離心5 min,離心半徑8 cm,1 500 r/min。去上清液,重懸,按1∶3比例接種到新的培養(yǎng)瓶,做好標記,繼續(xù)培養(yǎng)。取3～5代細胞用于實驗。本研究已通過南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院醫(yī)學倫理委員批準(倫理審批號:2017-074)。

1.1.2 藥物 下瘀血湯:生大黃(四川商宇藥業(yè)公司，批號:074180801),桃仁(上海哈靈公司，批號:120953-200705),土鱉蟲(廣東三藍公司，批號:Z19991101),由南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院中藥制劑室煎制,濃度為每毫升含生藥量0.4 g。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液(上海吉諾生物公司,貨號:CM0104),胎牛血清(杭州沃豐生物公司,貨號:SFBE),酶標儀(上海閃譜科技公司,型號:ReadMax 1900),流式細胞儀(賽默飛世爾科技生命科學產(chǎn)品，型號：Attune NxT)，胰蛋白酶(上海實維儀器技術公司,型號:9002-07-7)。

1.2 方法

1.2.1 分組與含藥血清制備 將培養(yǎng)的人肝癌細胞HepG2采用數(shù)字隨機法分為空白血清組、低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組。10只大鼠采用數(shù)字隨機法分為正常組及下瘀血湯湯組,常規(guī)喂養(yǎng),下瘀血湯組灌服(22.15 g/kg)水煎濃縮液,正常組給予同等劑量蒸餾水灌胃,2次/d,共干預1周,最后一次灌胃2 h后,正常組及下瘀血湯組大鼠均戊巴比妥麻醉(3%),心臟取血,分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 下瘀血湯干預方法 空白血清組:正常細胞在150 μL 10%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無血清培養(yǎng)基;低劑量含藥血清組:正常細胞在75 μL 2.5%大鼠下瘀血湯含藥血清+75 μL 7.5%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無血清培養(yǎng)基;中劑量含藥血清組:正常細胞在75 μL 5%大鼠下瘀血湯含藥血清+75 μL 5%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無血清培養(yǎng)基;高劑量含藥血清組:正常細胞在150 μL 10%大鼠下瘀血湯含藥血清+13.5 mL無血清培養(yǎng)基。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 MTT檢測各組肝癌細胞活性 將各組癌細胞(3×103個/孔)接種到96孔板中,貼壁后饑餓24 h,待細胞的密度培養(yǎng)到50%時,更換培養(yǎng)基,加入MTT于37.5 ℃,5%CO2下培養(yǎng),4 h后離棄上清液,加入DMSO,采用酶標儀于490 nm波長下測定光密度OD值。

1.2.3.2 實時PCR檢測各組Nanog的表達 用Trizol裂解各組HepG2細胞,提取RNA并逆轉錄,將逆轉后所得的cDNA進行熒光反應實驗。擴增條件為,94 ℃預變性5 min后,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 cycle,72 ℃延長10 min,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，G3PDH)為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3.3 蛋白質印跡法檢測Bcl-2、胱天蛋白酶-3的表達 將HepG2細胞細胞進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量,分裝后,保存在零下20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均,按照4∶1的比例進行電泳。后將蛋白樣品(50 μm)轉移聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入1抗按1∶100稀釋后孵育過夜,TTBS漂洗3次,10 min/次,最后加入2抗對溶液稀釋,常溫封閉。取出PVDF膜,漂洗1次/隔10 min,共3次,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色后照相,后計算其蛋白表達含量。

1.2.3.4 流失細胞儀檢測各組肝癌細胞的凋亡情況 收集細胞(2×105/孔)接種于6孔板中,胰蛋白酶消化,完全培養(yǎng)基終止;PBS清洗,進行細胞計數(shù)，1 250 r/min,離心半徑8 cm,離心6 min,棄上清,混入500 μL Binding Buffer(結合緩沖液)重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻、10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光孵育5～15 min,隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.3.5 Transwell法檢測各組肝癌細胞的侵襲力 各組MCF-7細胞接種與6孔板中,將50 mg/L的基質膠稀釋后加入小室上層,37 ℃下呈凝膠狀態(tài),細胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細胞懸液,下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基,37.5 ℃,培養(yǎng)2 d,取出培養(yǎng)基,拭去殘留細胞,現(xiàn)配結晶紫,每孔500 μL,將小室放入,25 ℃染色30 min,PBS清洗1次,晾干。顯微鏡觀察每個樣本連續(xù)選5清晰視野進行數(shù)量統(tǒng)計,然后計算器平均數(shù)。

2 結果

2.1 肝癌細胞活性比較 4組肝癌細胞OD值隨著時間的延長均有所增加,空白血清組與低劑量含藥血清組在不同時間點的細胞活性均較為接近(P>0.05)空白血清組在24 h、48 h、72 h時OD值均高于中劑量、高劑量含藥血清組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組任意2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組不同時間點肝癌細胞活性比較

2.2 肝癌細胞中Nanog mRNA的表達結果比較 空白血清組肝癌細胞中Nanog mRNA的水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組任意2組肝癌細胞中Nanog mRNA的水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組Nanog mRNA水平比較

2.3 肝癌細胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白表達結果比較 空白血清組肝癌細胞中Bcl-2的蛋白表達水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組(P<0.01),胱天蛋白酶-3的蛋白表達水平低于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組(P<0.01);低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組3組肝癌細胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白任意2組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見圖1、表4。

表4 各組Bcl-2、胱天蛋白酶-3水平比較

2.4 肝癌細胞凋亡率比較 空白組肝癌細胞凋亡最少，隨著藥物劑量的增加肝癌細胞凋亡增加，Q2與Q4相加顯示肝癌細胞凋亡數(shù)量。見圖2?？瞻籽褰M肝癌細胞凋亡率與低劑量含藥血清組比較明顯降低(P<0.01),中劑量含藥血清組肝癌細胞凋亡率高于低劑量含藥血清組(P<0.01),與中劑量含藥血清組比較,高劑量含藥血清組肝癌細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。見表5。

表5 各組細胞凋亡率比較

2.5 肝癌細胞侵襲能力比較 空白血清組肝癌細胞的侵襲數(shù)量高于低劑量含藥血清組(P<0.01),中劑量含藥血清組肝癌細胞的侵襲數(shù)量低于低劑量含藥血清組(P<0.01),高劑量含藥血清組肝癌細胞的侵襲數(shù)量最少,顯著低于其他3組(P<0.01)。見圖3、表6。

表6 各組細胞凋亡率比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)肝癌因素有多種,如病毒性肝炎、酒精性肝病等,患有乙肝、肝硬化患者肝癌發(fā)病率較高[12]。肝癌干細胞是肝癌的起始細胞,是一種具有很強的增殖分化能力的細胞,目前Nanog是肝癌干細胞的標志物,其對于干細胞的增殖分化等具有一定的調控作用[13],有關研究發(fā)現(xiàn),肝癌干細胞的增殖分化越強時,Nanog的表達水平越高,但目前為止未發(fā)現(xiàn)有何中藥物可調控其的表達,本研究探討藥物對Nanog的影響以及對肝癌細胞的作用。

下瘀血湯中大黃具有清瘀熱、活血化瘀等作用,其性寒,藥性沉穩(wěn);桃仁具有去除瘀血的功效,善于破除血滯[14];下瘀血湯中大黃的有效成分大黃素根據(jù)多種研究證實可阻礙多種腫瘤細胞的分化及增殖。根據(jù)相關研究表明,下瘀血湯中的桃仁可抗血栓、抗腫瘤等作用;土鱉蟲可破血逐瘀消積,具有促進胃癌等癌細胞凋亡等作用。在耿燕楠[15]研究下瘀血湯對胃癌細胞的實驗中表明,其可促進胃癌細胞的凋亡并抑制其生長。根據(jù)張浩等[16]研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯通過下調核仁紡錘相關蛋白1(Nucleolar Spindle-associated Protein 1,Nusap1)的表達進而阻礙肝癌細胞的增殖,同時又促使肝癌細胞凋亡加速。本研究的結果與上述研究結果相似。

肝癌干細胞具有自我復制、多項分化及自我增殖的功能,在體外特定條件下培養(yǎng)可抑制其分化,Nanog可通過結合靶基因調控區(qū),可有效地抑制其分化基因的表達[17]。Nanog在肝癌細胞中水平升高是由于Nanog具有自我分化分能力,在受到刺激后表達增高可影響癌細胞發(fā)展進程,使其分化增加,導致癌癥惡化。曾金敏等[18]研究Nanog對膀胱癌作用機制中發(fā)現(xiàn),Nanog被沉默后基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9的表達降低,且侵入到襯墊膜外側的T24細胞減少,其癌細胞侵襲力降低。楊曉文等[19]對肝癌細胞的研究中提出,下調Nanog的水平,可抑制癌細胞的增殖。本研究與上述研究結果相似,因此本研究認為,下瘀血湯可能是通過下調Nanog水平減少癌細胞的活性。

Bcl-2(B細胞淋巴瘤-2)是凋亡抑制的標志物,可聚集機體內(nèi)突變的物質,促使癌細胞發(fā)生發(fā)展,Bcl-2可通過P27來抑制細胞周期G1/S轉換,具有抑制細胞凋亡的作用[20]。劉曉宇和張紅[21]研究半邊蓮煎劑對肝癌的作用及對肝癌中P27及Bcl-2的影響時發(fā)現(xiàn),半邊蓮煎劑可以抑制肝癌的發(fā)展,其作用機制可能與半邊蓮抑制劑減弱了Bcl-2的表達、提高了P27的表達有關。大黃是下瘀血湯中的一味中藥材。孫瑋[22]研究乳腺癌的研究中提出,大黃可降低Bcl-2的水平,促進癌細胞的凋亡。

胱天蛋白酶-3是由多腺苷二磷酸核糖聚合酶及APD-核糖組成細胞凋亡的執(zhí)行蛋白酶,是一種凋亡信號蛋白,對于細胞凋亡凋亡有正向促進作用,當細胞凋亡時,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的聯(lián)系被切斷,使鋅指結構與催化區(qū)域分離,導致功能發(fā)揮異常,加劇凋亡[23]。孫媛和李青山[24]等通過沙利度胺聯(lián)合葉酸、氟尿嘧啶、奧沙利鉑(Folinic Acid Fluorouracil Oxaliplatin,FOLFOX)促進了肝癌細胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),其作用機制與激活胱天蛋白酶-3信號通路有關。根據(jù)耿燕楠[15]的研究表明,下瘀血湯對于胃癌裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯對胃癌裸鼠異種移植瘤的抑制率為36.5%,其機制與調控胱天蛋白酶-3、Bcl-2蛋白表達有關,這與本研究結果相似,說明下瘀血湯促進肝癌細胞凋亡可能與下調Bcl-2、提高胱天蛋白酶-3的表達有關。

綜上所述,下瘀血湯通可抑制肝癌細胞的活性及其侵襲能力、促進癌細胞的凋亡,其作用機制可能調控與Nanog信號通路,從而促進胱天蛋白酶-3的表達、抑制Bcl-2水平有關。