郭彩茹,谷云飛,牛宇杰,王皓
急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急危重癥,起病急,病死率高,嚴(yán)重威脅人類健康。盡管自上世紀(jì)末,循證指南和再灌注治療的廣泛應(yīng)用使AMI預(yù)后得到改善,但缺血再灌注損傷卻始終困擾著臨床。INFUSE-AMI研究顯示,發(fā)病3 h內(nèi)及時完成的經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(PCI),僅能使AMI患者1年死亡率降低9.2%[1]。一項(xiàng)前瞻性多中心注冊研究發(fā)現(xiàn),盡管給予合理的藥物治療和及時的再灌注治療,但AMI患者住院死亡率仍高達(dá)5.4%,住院期間心力衰竭(心衰)發(fā)生率高達(dá)14.2%,缺血再灌注損傷是影響患者最終梗死面積和預(yù)后的重要因素[2]。因此,如何減輕缺血再灌注損傷,在現(xiàn)有治療的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善AMI患者預(yù)后,是目前心血管領(lǐng)域亟待解決的難題。既往研究顯示,黃芪多糖具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用,但具體機(jī)制不明[3-5]。我們經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn),肌肉因子irisin能有效對抗缺氧復(fù)氧/缺血再灌注造成的一系列損傷,包括心肌細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等,可顯著減少心梗面積,減輕心功能損害[6,7]。文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn),黃芪的主要有效成分—黃芪多糖(APS)對PGC-1α的表達(dá)具有顯著調(diào)節(jié)作用,而irisin正是依賴PGC-1α調(diào)節(jié)[8]。因此,本研究擬在H9C2心肌細(xì)胞體外過氧化氫損傷模型中,探索黃芪多糖的心肌保護(hù)作用是否通過調(diào)節(jié)PGC-1α/irisin途徑實(shí)現(xiàn),旨在為進(jìn)一步改善急性心梗患者預(yù)后提供新的思路和治療靶點(diǎn)。
1.1 H9C2細(xì)胞、試劑來源H9C2細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司),Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、胎牛血清和無菌磷酸緩沖鹽溶液(格蘭德島生物公司),裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)多克隆兔抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(bcl-2)多克隆兔抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(bax)多克隆兔抗體以及β-actin單克隆小鼠抗體等(艾博抗公司)。蛋白質(zhì)印跡用辣根過氧化物酶結(jié)合二抗(美國英杰生命技術(shù)有限公司),蛋白質(zhì)印跡條帶顯影用電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司),蛋白質(zhì)提取用放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)、蛋白濃度測定用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白分析試劑盒和MTT試劑盒等(西格瑪奧德里奇公司)。蛋白質(zhì)印跡用聚偏二氟乙烯膜膜(PVDF)購自伯樂公司(Bio-Rad),免疫熒光用山羊抗兔AlexaFluor555二抗及細(xì)胞核染色用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于賽默飛公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒和總核糖核酸(RNA)提取試劑盒購自碧云天公司。一步法除基因組互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)第一鏈合成預(yù)混試劑盒以及熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版[SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)]購于天根生化科技有限公司。TUNEL檢測試劑盒購于索萊寶公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9C2細(xì)胞采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)定27℃含5%CO2,每2~3 d更換新鮮培養(yǎng)基,細(xì)胞生長至70%~80%時擴(kuò)增傳代。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理采用H9C2心肌細(xì)胞體外H2O2損傷模擬缺氧復(fù)氧損傷時的氧化應(yīng)激。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基血清饑餓12 h使細(xì)胞周期同步。根據(jù)處理不同分為4組:①對照組:血清饑餓后正常培養(yǎng),不添加APS和H2O2;②對照+APS組:血清饑餓后加入APS(100 μg/ml)孵育2 h,不進(jìn)行H2O2損傷;③H2O2損傷組:血清饑餓后不加APS,正常培養(yǎng)2 h后,加H2O2(500 μmol/L)孵育12 h;④H2O2損傷+APS組:血清饑餓后加入APS(100 μg/ml)孵育2 h,隨后加入H2O2(500 μmol/L)孵育12 h。
1.3.3 細(xì)胞死亡率檢測通過檢測細(xì)胞LDH漏出量,評估細(xì)胞死亡率。具體步驟如下:采用24孔板鋪板,每板留取3孔不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基,作為培養(yǎng)基背景對照孔。其余孔培養(yǎng)至細(xì)胞密度50%~60%后造模,造模結(jié)束前1 h,在對照組隨機(jī)選擇3孔,加入試劑盒配套的裂解液,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h,制作LDH最大釋放孔。取上清液加入96孔培養(yǎng)板,120 μl/孔,隨后加入60 μl試劑盒配套的乳酸溶液和碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)溶液、酶溶液的混合液。室溫下避光反應(yīng)30 min,酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度。細(xì)胞死亡率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-培養(yǎng)基背景吸光度)/(最大LDH釋放對照組吸光度-培養(yǎng)基背景吸光度)×100%。
1.3.4 細(xì)胞生存率檢測采用MTT試劑盒評估細(xì)胞存活率。具體步驟如下:96孔板鋪板造模,造模結(jié)束后,棄上清液,1×PBS清洗3遍,每次3 min,每孔加入100 μl 1×PBS和10 μl MTT試劑,置于培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)中孵育4 h,取出培養(yǎng)板丟棄上清液,加MTT溶解液,100 μl/孔,溶解10 min。酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度。以對照組為參照值100%,對每組存活率進(jìn)行統(tǒng)計分析。
1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測①caspase3+DAPI免疫熒光染色:用24孔板鋪板造模,造模結(jié)束后棄上清液,室溫下1×PBS清洗3 min。加入4%多聚甲醛室溫固定20 min(500 μl/孔),1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入0.5%曲拉通X-100(Triton-X100)穿孔,室溫下20 min(500 μl/孔),1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。1%牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉1 h(500 μl/孔)。1×PBS清洗3遍,每次3 min (500 μl/孔)。加入1%BSA稀釋的caspase3抗體(種屬:兔抗大鼠,濃度:1:200,300 μl/孔),室溫避光反應(yīng)2 h。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入1%BSA稀釋的AlexaFluor555二抗(種屬:羊抗兔,濃度:1:1000,300 μl/孔),室溫避光反應(yīng)1 h。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入1 μg/ml DAPI染色室溫避光染色3 min(300 μl/孔)。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入1×PBS,每孔300 μl,直接于熒光顯微鏡下觀察。視野中藍(lán)染為細(xì)胞核,用于評估每個視野下的細(xì)胞總數(shù);紅染的細(xì)胞即為caspase3陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。計算每個視野下細(xì)胞凋亡率,即caspase3陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%,每組計數(shù)20個視野,求平均值。進(jìn)行統(tǒng)計分析。②TUNEL檢測:使用24孔板鋪板造模,造模結(jié)束后棄上清液。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入4%多聚甲醛室溫固定20 min(500 μl/孔),1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。向每孔中加入200 μl TUNEL工作液(50 μl反應(yīng)緩沖液+0.5 μl 100×Tunelyte Red),避光37℃孵育1 h,去掉工作液,1×PBS清洗3遍,加入1 μg/ml DAPI染色室溫避光染色3 min(300 μl/孔)。1×PBS清洗3遍,每次3 min(500 μl/孔)。加入1×PBS,每孔300 μl,直接于熒光顯微鏡下觀察。視野中藍(lán)染為細(xì)胞核,用于評估每個視野下的細(xì)胞總數(shù);紅染的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。計算每個視野下細(xì)胞凋亡率,即TUNEL陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%,每組計數(shù)20個視野,求平均值。進(jìn)行統(tǒng)計分析。③檢測凋亡相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平:采用RT-PCR檢測和蛋白質(zhì)印跡檢測caspase9、bax以及bcl-2等凋亡或抗凋亡相關(guān)分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平,具體方法見下文。
1.3.6 PCR檢測凋亡及信號通路相關(guān)分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后,采用總RNA抽提試劑(Trizol)提取細(xì)胞總RNA,使用超微量紫外分光光度計(Nano drop 2000)測定總RNA濃度,按照FastKing一步法基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成,按照SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),具體反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個循環(huán),溶解曲線分析。每組3個孔,重復(fù)3次。所用引物具體如下:
1.3.7 蛋白質(zhì)印跡檢測凋亡及信號通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平采用蛋白質(zhì)印跡檢測上述凋亡相關(guān)分子以及PGC-1α、irisin等信號通路分子的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平。具體方法如下:根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適分離膠濃度,最外側(cè)兩孔加marker,中間上樣。恒壓電泳,首先用80 V電壓,待蛋白跑至濃縮膠與分離膠分界處,改換120 V電壓,電泳至距分離膠底緣0.5 cm處停止電泳;120 V轉(zhuǎn)膜,冰上操作1 h;5%脫脂奶粉封閉,搖床,室溫1 h;以marker為分子量標(biāo)尺,將PVDF膜切開,分別孵育對應(yīng)目標(biāo)蛋白的一抗;將一抗按預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整后所需濃度,用5%BSA稀釋,室溫?fù)u床孵育1 h,放入4 ℃冰箱搖床孵育過夜;回收一抗,膜在室溫下用1×PBS清洗3遍,每次5 min;將二抗按預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整后所需濃度,用5%脫脂奶粉稀釋,室溫?fù)u床孵育1 h;室溫下用1×PBS清洗3遍,每次5 min;ECL試劑盒顯色;上海天能凝膠成像儀(Tanon 5200M ulti)拍照。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism軟件(version 5.0)完成。本課題所有數(shù)據(jù)均為連續(xù)型變量,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢測,組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni校正。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 APS對心肌細(xì)胞死亡率的影響與對照組相比,H2O2損傷后,H2O2組細(xì)胞死亡率顯著提高[(12.81±0.71)% vs.(23.3±1.14)%,P<0.001]。而與H2O2組相比,APS預(yù)處理可將死亡率降至(16.93±0.64)%,(P<0.01),圖1。
圖1 APS對心肌細(xì)胞死亡率的影響(H2O2:過氧化氫;APS:黃芪多糖)
2.2 APS對心肌細(xì)胞存活率的影響H2O2損傷后,細(xì)胞存活率從100%降至(39.95±4.9)%,(P<0.001),而APS處理將細(xì)胞生存率提高至(65.77±5.08)%,(P<0.05),圖2。
圖2 APS對心肌細(xì)胞存活率的影響(H2O2:過氧化氫;APS:黃芪多糖)
2.3 APS對心肌細(xì)胞凋亡的影響采用caspase3免疫熒光染色、TUNEL及凋亡相關(guān)因子表達(dá)檢測等評價心肌細(xì)胞凋亡情況。圖3A和圖3B顯示了caspase3染色的結(jié)果,與對照組相比,H2O2顯著增加caspase3陽性細(xì)胞數(shù)量,而APS可將細(xì)胞凋亡率從(18.90±1.14)%降至(4.80±0.39)%,(P<0.001),圖3B。TUNEL結(jié)果也顯示出同樣趨勢,圖3C。圖3D-E的PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測示,APS能夠顯著抑制H2O2損傷造成的caspase9、bax等凋亡因子表達(dá),促進(jìn)bcl-2抗凋亡因子表達(dá)。
圖3 APS對細(xì)胞凋亡的影響
2.4 APS對PGC-1α/irisin信號通路的影響采用PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測對APS處理后,PGC-1α/irisin信號通路的變化進(jìn)行了檢測, APS處理能夠促進(jìn)PGC-1α和irisin的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平(P<0.05),圖4。
圖4 APS對PGC-1α/irisin信號通路的影響
黃芪是歷代中醫(yī)最為常用的中藥之一,由豆科植物蒙古黃芪的干燥根莖無菌提取而成,具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等多重作用[9-11],在心血管領(lǐng)域也備受研究人員的青睞。趙淑敏等[12]在大鼠缺血再灌注模型中的研究發(fā)現(xiàn),術(shù)前1周起每日腹腔注射黃芪注射液2 ml(含4 g黃芪),能夠顯著減輕缺血再灌注對心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)造成的損傷。景桂霞等[13]研究發(fā)現(xiàn),術(shù)前單次黃芪注射液預(yù)處理,能顯著改善缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷程度,減少三磷酸腺苷(ATP)分解,減輕鈣超載、氧自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng),但具體機(jī)制仍不明確。
APS是黃芪的主要成分之一?;瘜W(xué)式為C10H7ClN2O2S。經(jīng)提純后的APS為淡黃色細(xì)膩粉末,均勻無雜質(zhì)。其是一種水溶性雜多糖,由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成。Luan等[14]研究發(fā)現(xiàn),APS能夠調(diào)節(jié)PGC-1α介導(dǎo)的能量代謝反應(yīng),對抗異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌重構(gòu)。Huang等[15]在慢性過度運(yùn)動損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn),APS能夠抑制過度運(yùn)動造成的PGC-1α表達(dá)下降,減輕骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激,保護(hù)線粒體功能。Gu等[8]在追趕生長大鼠模型中發(fā)現(xiàn),連續(xù)給予大鼠APS口服治療8周,可激活PGC-1α/過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)通路,減輕大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。
PGC-1α是目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控irisin表達(dá)的最主要的因子。其中,irisin是由Bostrom等[16]在2012年首次發(fā)現(xiàn)的一種肌肉因子。它包含209個氨基酸殘基,分子量約為32 kDa,是由包含Ⅲ型纖連蛋白重復(fù)序列基因家族中的一員—含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5(FNDC5)裂解、釋放產(chǎn)生[17,18]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),irisin能夠顯著減輕缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,增加細(xì)胞存活率,降低caspase 3、annexin Ⅴ等細(xì)胞凋亡標(biāo)記物的表達(dá)水平,同時還可以抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的線粒體跨膜電勢(MTP)崩潰,減少線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放,防止線粒體/胞漿屏障的破壞,減輕線粒體腫脹及凋亡,維持線粒體功能。另外,在動物實(shí)驗(yàn)中,通過給予缺血再灌注損傷的小鼠心臟外源性補(bǔ)充irisin,率先在整體動物水平上證實(shí)了irisin對心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。在本研究中,irisin能夠減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心臟功能損害,降低凋亡標(biāo)記物表達(dá),同時增加超氧化物歧化酶的表達(dá)水平,促進(jìn)氧自由基清除,減少心肌梗死面積。Irisin在所有已經(jīng)測序的哺乳類動物種類中其序列高度保守,在骨骼肌、心肌、大腦等代謝活躍的組織表達(dá)較高[16,19]。目前認(rèn)為,irisin的表達(dá)主要受PGC-1α調(diào)控。用其上游激動劑非諾貝特處理肥胖小鼠白色脂肪組織后,irisin基因的表達(dá)量顯著升高,白色脂肪出現(xiàn)棕色化特征,提示其活化會誘導(dǎo)irisin的表達(dá)[20]。且在小鼠肌肉中過表達(dá)PGC-1α,同樣能夠顯著刺激irisin的前體FNDC5的表達(dá),增加irisin含量,在骨骼肌PGC-1α特異性敲除的小鼠中,F(xiàn)NDC5的mRNA表達(dá)量則明顯下調(diào),均提示PGC-1α與irisin的表達(dá)密切相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)APS能夠有效對抗H2O2造成的心肌細(xì)胞損傷和死亡,PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示,APS能夠促進(jìn)PGC-1α/irisin信號通路的激活,與文獻(xiàn)和我們既往的研究一致。
綜上所述,本研究提示APS可能是一種潛在的心血管保護(hù)藥物,其保護(hù)作用至少部分是通過激活PGC-1α/irisin通路實(shí)現(xiàn)。多糖是一種重要的生物大分子,具有多種生物學(xué)功能。其細(xì)胞毒性小、副作用少、性質(zhì)穩(wěn)定和不易變性失活,是藥物的理想選擇。因此,APS具有良好的轉(zhuǎn)化前景。未來有待于動物實(shí)驗(yàn)對APS的保護(hù)作用進(jìn)行深入挖掘和驗(yàn)證。