郭彩茹，谷云飛，牛宇杰，王皓

急性心肌梗死（AMI）是臨床常見的急危重癥，起病急，病死率高，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管自上世紀(jì)末，循證指南和再灌注治療的廣泛應(yīng)用使AMI預(yù)后得到改善，但缺血再灌注損傷卻始終困擾著臨床。INFUSE-AMI研究顯示，發(fā)病3 h內(nèi)及時完成的經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（PCI），僅能使AMI患者1年死亡率降低9.2%[1]。一項(xiàng)前瞻性多中心注冊研究發(fā)現(xiàn)，盡管給予合理的藥物治療和及時的再灌注治療，但AMI患者住院死亡率仍高達(dá)5.4%，住院期間心力衰竭（心衰）發(fā)生率高達(dá)14.2%，缺血再灌注損傷是影響患者最終梗死面積和預(yù)后的重要因素[2]。因此，如何減輕缺血再灌注損傷，在現(xiàn)有治療的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善AMI患者預(yù)后，是目前心血管領(lǐng)域亟待解決的難題。既往研究顯示，黃芪多糖具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，但具體機(jī)制不明[3-5]。我們經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，肌肉因子irisin能有效對抗缺氧復(fù)氧/缺血再灌注造成的一系列損傷，包括心肌細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等，可顯著減少心梗面積，減輕心功能損害[6,7]。文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要有效成分—黃芪多糖（APS）對PGC-1α的表達(dá)具有顯著調(diào)節(jié)作用，而irisin正是依賴PGC-1α調(diào)節(jié)[8]。因此，本研究擬在H9C2心肌細(xì)胞體外過氧化氫損傷模型中，探索黃芪多糖的心肌保護(hù)作用是否通過調(diào)節(jié)PGC-1α/irisin途徑實(shí)現(xiàn)，旨在為進(jìn)一步改善急性心梗患者預(yù)后提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 H9C2細(xì)胞、試劑來源H9C2細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、胎牛血清和無菌磷酸緩沖鹽溶液（格蘭德島生物公司），裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase3）多克隆兔抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2（bcl-2）多克隆兔抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（bax）多克隆兔抗體以及β-actin單克隆小鼠抗體等（艾博抗公司）。蛋白質(zhì)印跡用辣根過氧化物酶結(jié)合二抗（美國英杰生命技術(shù)有限公司），蛋白質(zhì)印跡條帶顯影用電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司），蛋白質(zhì)提取用放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）、蛋白濃度測定用聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白分析試劑盒和MTT試劑盒等（西格瑪奧德里奇公司）。蛋白質(zhì)印跡用聚偏二氟乙烯膜膜（PVDF）購自伯樂公司（Bio-Rad），免疫熒光用山羊抗兔AlexaFluor555二抗及細(xì)胞核染色用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購于賽默飛公司。乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒和總核糖核酸（RNA）提取試劑盒購自碧云天公司。一步法除基因組互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）第一鏈合成預(yù)混試劑盒以及熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版[SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）]購于天根生化科技有限公司。TUNEL檢測試劑盒購于索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9C2細(xì)胞采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)定27℃含5%CO2，每2~3 d更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至70%~80%時擴(kuò)增傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理采用H9C2心肌細(xì)胞體外H2O2損傷模擬缺氧復(fù)氧損傷時的氧化應(yīng)激。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基血清饑餓12 h使細(xì)胞周期同步。根據(jù)處理不同分為4組：①對照組：血清饑餓后正常培養(yǎng)，不添加APS和H2O2；②對照+APS組：血清饑餓后加入APS（100 μg/ml）孵育2 h，不進(jìn)行H2O2損傷；③H2O2損傷組：血清饑餓后不加APS，正常培養(yǎng)2 h后，加H2O2（500 μmol/L）孵育12 h；④H2O2損傷+APS組：血清饑餓后加入APS（100 μg/ml）孵育2 h，隨后加入H2O2（500 μmol/L）孵育12 h。

1.3.3 細(xì)胞死亡率檢測通過檢測細(xì)胞LDH漏出量，評估細(xì)胞死亡率。具體步驟如下：采用24孔板鋪板，每板留取3孔不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基背景對照孔。其余孔培養(yǎng)至細(xì)胞密度50%~60%后造模，造模結(jié)束前1 h，在對照組隨機(jī)選擇3孔，加入試劑盒配套的裂解液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，制作LDH最大釋放孔。取上清液加入96孔培養(yǎng)板，120 μl/孔，隨后加入60 μl試劑盒配套的乳酸溶液和碘硝基氯化四氮唑藍(lán)（INT）溶液、酶溶液的混合液。室溫下避光反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度。細(xì)胞死亡率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度－培養(yǎng)基背景吸光度）/（最大LDH釋放對照組吸光度－培養(yǎng)基背景吸光度）×100%。

1.3.4 細(xì)胞生存率檢測采用MTT試劑盒評估細(xì)胞存活率。具體步驟如下：96孔板鋪板造模，造模結(jié)束后，棄上清液，1×PBS清洗3遍，每次3 min，每孔加入100 μl 1×PBS和10 μl MTT試劑，置于培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中孵育4 h，取出培養(yǎng)板丟棄上清液，加MTT溶解液，100 μl/孔，溶解10 min。酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度。以對照組為參照值100%，對每組存活率進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測①caspase3+DAPI免疫熒光染色：用24孔板鋪板造模，造模結(jié)束后棄上清液，室溫下1×PBS清洗3 min。加入4%多聚甲醛室溫固定20 min（500 μl/孔），1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入0.5%曲拉通X-100（Triton-X100）穿孔，室溫下20 min（500 μl/孔），1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。1%牛血清白蛋白（BSA）室溫下封閉1 h（500 μl/孔）。1×PBS清洗3遍，每次3 min （500 μl/孔）。加入1%BSA稀釋的caspase3抗體（種屬：兔抗大鼠，濃度：1:200，300 μl/孔），室溫避光反應(yīng)2 h。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入1%BSA稀釋的AlexaFluor555二抗（種屬：羊抗兔，濃度：1:1000，300 μl/孔），室溫避光反應(yīng)1 h。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入1 μg/ml DAPI染色室溫避光染色3 min（300 μl/孔）。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入1×PBS，每孔300 μl，直接于熒光顯微鏡下觀察。視野中藍(lán)染為細(xì)胞核，用于評估每個視野下的細(xì)胞總數(shù)；紅染的細(xì)胞即為caspase3陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。計算每個視野下細(xì)胞凋亡率，即caspase3陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%，每組計數(shù)20個視野，求平均值。進(jìn)行統(tǒng)計分析。②TUNEL檢測：使用24孔板鋪板造模，造模結(jié)束后棄上清液。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入4%多聚甲醛室溫固定20 min（500 μl/孔），1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。向每孔中加入200 μl TUNEL工作液（50 μl反應(yīng)緩沖液+0.5 μl 100×Tunelyte Red），避光37℃孵育1 h，去掉工作液，1×PBS清洗3遍，加入1 μg/ml DAPI染色室溫避光染色3 min（300 μl/孔）。1×PBS清洗3遍，每次3 min（500 μl/孔）。加入1×PBS，每孔300 μl，直接于熒光顯微鏡下觀察。視野中藍(lán)染為細(xì)胞核，用于評估每個視野下的細(xì)胞總數(shù)；紅染的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。計算每個視野下細(xì)胞凋亡率，即TUNEL陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%，每組計數(shù)20個視野，求平均值。進(jìn)行統(tǒng)計分析。③檢測凋亡相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平：采用RT-PCR檢測和蛋白質(zhì)印跡檢測caspase9、bax以及bcl-2等凋亡或抗凋亡相關(guān)分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，具體方法見下文。

1.3.6 PCR檢測凋亡及信號通路相關(guān)分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，采用總RNA抽提試劑（Trizol）提取細(xì)胞總RNA，使用超微量紫外分光光度計（Nano drop 2000）測定總RNA濃度，按照FastKing一步法基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，按照SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)，溶解曲線分析。每組3個孔，重復(fù)3次。所用引物具體如下：

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡檢測凋亡及信號通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平采用蛋白質(zhì)印跡檢測上述凋亡相關(guān)分子以及PGC-1α、irisin等信號通路分子的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平。具體方法如下：根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適分離膠濃度，最外側(cè)兩孔加marker，中間上樣。恒壓電泳，首先用80 V電壓，待蛋白跑至濃縮膠與分離膠分界處，改換120 V電壓，電泳至距分離膠底緣0.5 cm處停止電泳；120 V轉(zhuǎn)膜，冰上操作1 h；5%脫脂奶粉封閉，搖床，室溫1 h；以marker為分子量標(biāo)尺，將PVDF膜切開，分別孵育對應(yīng)目標(biāo)蛋白的一抗；將一抗按預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整后所需濃度，用5%BSA稀釋，室溫?fù)u床孵育1 h，放入4 ℃冰箱搖床孵育過夜；回收一抗，膜在室溫下用1×PBS清洗3遍，每次5 min；將二抗按預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整后所需濃度，用5%脫脂奶粉稀釋，室溫?fù)u床孵育1 h；室溫下用1×PBS清洗3遍，每次5 min；ECL試劑盒顯色；上海天能凝膠成像儀（Tanon 5200M ulti）拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism軟件（version 5.0）完成。本課題所有數(shù)據(jù)均為連續(xù)型變量，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢測，組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni校正。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對心肌細(xì)胞死亡率的影響與對照組相比，H2O2損傷后，H2O2組細(xì)胞死亡率顯著提高[（12.81±0.71）% vs.（23.3±1.14）%，P＜0.001]。而與H2O2組相比，APS預(yù)處理可將死亡率降至（16.93±0.64）%，（P＜0.01），圖1。

圖1 APS對心肌細(xì)胞死亡率的影響（H2O2：過氧化氫；APS：黃芪多糖）

2.2 APS對心肌細(xì)胞存活率的影響H2O2損傷后，細(xì)胞存活率從100%降至（39.95±4.9）%，（P＜0.001），而APS處理將細(xì)胞生存率提高至（65.77±5.08）%，（P＜0.05），圖2。

圖2 APS對心肌細(xì)胞存活率的影響（H2O2：過氧化氫；APS：黃芪多糖）

2.3 APS對心肌細(xì)胞凋亡的影響采用caspase3免疫熒光染色、TUNEL及凋亡相關(guān)因子表達(dá)檢測等評價心肌細(xì)胞凋亡情況。圖3A和圖3B顯示了caspase3染色的結(jié)果，與對照組相比，H2O2顯著增加caspase3陽性細(xì)胞數(shù)量，而APS可將細(xì)胞凋亡率從（18.90±1.14）%降至（4.80±0.39）%，（P＜0.001），圖3B。TUNEL結(jié)果也顯示出同樣趨勢，圖3C。圖3D-E的PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測示，APS能夠顯著抑制H2O2損傷造成的caspase9、bax等凋亡因子表達(dá)，促進(jìn)bcl-2抗凋亡因子表達(dá)。

圖3 APS對細(xì)胞凋亡的影響

2.4 APS對PGC-1α/irisin信號通路的影響采用PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測對APS處理后，PGC-1α/irisin信號通路的變化進(jìn)行了檢測， APS處理能夠促進(jìn)PGC-1α和irisin的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平（P＜0.05），圖4。

圖4 APS對PGC-1α/irisin信號通路的影響

3 討論

黃芪是歷代中醫(yī)最為常用的中藥之一，由豆科植物蒙古黃芪的干燥根莖無菌提取而成，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等多重作用[9-11]，在心血管領(lǐng)域也備受研究人員的青睞。趙淑敏等[12]在大鼠缺血再灌注模型中的研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前1周起每日腹腔注射黃芪注射液2 ml（含4 g黃芪），能夠顯著減輕缺血再灌注對心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)造成的損傷。景桂霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前單次黃芪注射液預(yù)處理，能顯著改善缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷程度，減少三磷酸腺苷（ATP）分解，減輕鈣超載、氧自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，但具體機(jī)制仍不明確。

APS是黃芪的主要成分之一?；瘜W(xué)式為C10H7ClN2O2S。經(jīng)提純后的APS為淡黃色細(xì)膩粉末，均勻無雜質(zhì)。其是一種水溶性雜多糖，由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成。Luan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠調(diào)節(jié)PGC-1α介導(dǎo)的能量代謝反應(yīng)，對抗異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌重構(gòu)。Huang等[15]在慢性過度運(yùn)動損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，APS能夠抑制過度運(yùn)動造成的PGC-1α表達(dá)下降，減輕骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體功能。Gu等[8]在追趕生長大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給予大鼠APS口服治療8周，可激活PGC-1α/過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）通路，減輕大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

PGC-1α是目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控irisin表達(dá)的最主要的因子。其中，irisin是由Bostrom等[16]在2012年首次發(fā)現(xiàn)的一種肌肉因子。它包含209個氨基酸殘基，分子量約為32 kDa，是由包含Ⅲ型纖連蛋白重復(fù)序列基因家族中的一員—含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5（FNDC5）裂解、釋放產(chǎn)生[17,18]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，irisin能夠顯著減輕缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，增加細(xì)胞存活率，降低caspase 3、annexin Ⅴ等細(xì)胞凋亡標(biāo)記物的表達(dá)水平，同時還可以抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的線粒體跨膜電勢（MTP）崩潰，減少線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，防止線粒體/胞漿屏障的破壞，減輕線粒體腫脹及凋亡，維持線粒體功能。另外，在動物實(shí)驗(yàn)中，通過給予缺血再灌注損傷的小鼠心臟外源性補(bǔ)充irisin，率先在整體動物水平上證實(shí)了irisin對心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。在本研究中，irisin能夠減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心臟功能損害，降低凋亡標(biāo)記物表達(dá)，同時增加超氧化物歧化酶的表達(dá)水平，促進(jìn)氧自由基清除，減少心肌梗死面積。Irisin在所有已經(jīng)測序的哺乳類動物種類中其序列高度保守，在骨骼肌、心肌、大腦等代謝活躍的組織表達(dá)較高[16,19]。目前認(rèn)為，irisin的表達(dá)主要受PGC-1α調(diào)控。用其上游激動劑非諾貝特處理肥胖小鼠白色脂肪組織后，irisin基因的表達(dá)量顯著升高，白色脂肪出現(xiàn)棕色化特征，提示其活化會誘導(dǎo)irisin的表達(dá)[20]。且在小鼠肌肉中過表達(dá)PGC-1α，同樣能夠顯著刺激irisin的前體FNDC5的表達(dá)，增加irisin含量，在骨骼肌PGC-1α特異性敲除的小鼠中，F(xiàn)NDC5的mRNA表達(dá)量則明顯下調(diào)，均提示PGC-1α與irisin的表達(dá)密切相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)APS能夠有效對抗H2O2造成的心肌細(xì)胞損傷和死亡，PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示，APS能夠促進(jìn)PGC-1α/irisin信號通路的激活，與文獻(xiàn)和我們既往的研究一致。

綜上所述，本研究提示APS可能是一種潛在的心血管保護(hù)藥物，其保護(hù)作用至少部分是通過激活PGC-1α/irisin通路實(shí)現(xiàn)。多糖是一種重要的生物大分子，具有多種生物學(xué)功能。其細(xì)胞毒性小、副作用少、性質(zhì)穩(wěn)定和不易變性失活，是藥物的理想選擇。因此，APS具有良好的轉(zhuǎn)化前景。未來有待于動物實(shí)驗(yàn)對APS的保護(hù)作用進(jìn)行深入挖掘和驗(yàn)證。