羅 娜，楊 啟（.南陽(yáng)市中心醫(yī)院西藥科，河南 南陽(yáng) 473000；.南陽(yáng)市中心醫(yī)院肝臟普外科，河南 南陽(yáng) 473000）

益母草是益母草干燥全草，具有活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱解毒之功效，臨床常用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)等。益母草堿是益母草中的生物堿，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保護(hù)神經(jīng)等作用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，益母草堿對(duì)肺癌細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用[3]，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，但關(guān)于益母草堿對(duì)宮頸癌的抗腫瘤作用尚不明確。LINC00461是近年發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌等組織中LINC00461表達(dá)上調(diào)，通過(guò)調(diào)控不同通路或miRNA參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等過(guò)程，發(fā)揮致癌基因作用，這表明LINC0046有望成為腫瘤的潛在標(biāo)志物[4-5]。本研究通過(guò)相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LINC00461在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。鑒于此，本研究以宮頸癌細(xì)胞株SiHa作為研究對(duì)象，探究益母草堿能否通過(guò)調(diào)控LINC00461影響宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡，以期為日后相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞株SiHa購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心；鹽酸益母草堿購(gòu)自南京迪兆生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；LINC00461過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-LINC00461）和陰性對(duì)照pcDNA3.1載體購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；p21抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 將SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化傳代。將細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，在培養(yǎng)液中加入終濃度為10、20、30 μg·mL-1的益母草堿，分別記為益母草A、B、C組，未經(jīng)過(guò)益母草堿處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，以1 ～ 2×l05個(gè)·孔-1細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)融合度為80%～ 90%時(shí)，分別將pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，對(duì)應(yīng)設(shè)為pcDNA3.1-LINC00461組和pcDNA3.1組。pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后，加入30 μg·mL-1益母草堿，記為益母草C + pcDNA3.1組、益母草C + pcDNA3.1-LINC00461組，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或藥物處理。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)LINC00461相對(duì)表達(dá)量 收集各組SiHa細(xì)胞，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照Real-time PCR的說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)合成LINC00461和mRNA。LINC00461上游引物：5'-GACATTTACGCCACAACCCACG-3'，下游引物：5'-AGACAGACCCTCAGATTCCCCA-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3'，下游引物：5'-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3'。運(yùn)用2?ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集轉(zhuǎn)染、益母草堿處理72 h后的SiHa細(xì)胞，以2×103個(gè)·孔-1（100 μL細(xì)胞）接種于96孔板中，加10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將藥物處理或轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞以每皿約100個(gè)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 mL培養(yǎng)液混勻，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼清晰可見(jiàn)的細(xì)胞克?。s10 ～ 14 d），棄培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞2次，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將SiHa細(xì)胞以2×105個(gè)·孔-1接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，用益母草堿處理72 h，消化收集細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶，避光20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的、益母草堿處理的各組SiHa細(xì)胞進(jìn)行裂解收集蛋白。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗（p21 1∶1000稀釋，Caspase-3 1∶1000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，加稀釋的二抗，室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組相比，益母草堿A、B、C組細(xì)胞存活率、克隆形成數(shù)均降低，細(xì)胞凋亡率升高，p21和Caspase-3蛋白表達(dá)量均升高，且具有劑量依賴趨勢(shì)（P < 0.05），見(jiàn)表1。根據(jù)結(jié)果，后期實(shí)驗(yàn)選用存活率約為50%的益母草堿濃度（30 μg·mL-1）。

表1 不同濃度益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響. n = 9Tab 1 Effect of different concentration of leonurine on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.2 益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞中LINC00461相對(duì)表達(dá)量的影響

對(duì)照組SiHa細(xì)胞中LINC00461的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.05），益母草C組SiHa細(xì)胞中LINC00461的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.03），與對(duì)照組相比，益母草C組SiHa細(xì)胞中LINC00461的相對(duì)表達(dá)量降低（t =33.442，P < 0.05）。

2.3 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00461組LINC00461相對(duì)表達(dá)量升高，p21和Caspase-3蛋白表達(dá)降低，凋亡率下降，細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)升高（P < 0.05），見(jiàn)表2。

表2 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響. n = 9Tab 2 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.4 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)益母草堿作用的SiHa細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，益母草C組p21蛋白表達(dá)量升高，存活率和克隆形成數(shù)均降低（P <0.05）；與益母草C + pcDNA3.1組相比，益母草C +pcDNA3.1-LINC00461組p21蛋白表達(dá)量降低，存活率和克隆形成數(shù)均升高（P < 0.05），見(jiàn)表3。

表3 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)益母草堿作用的SiHa細(xì)胞增殖的影響. n = 9Tab 3 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

2.5 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)益母草堿作用的SiHa細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，益母草C組Caspase-3蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均升高（P < 0.05）；與益母草C + pcDNA3.1組相比，益母草C + pcDNA3.1-LINC00461組中Caspase3蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均降低（P < 0.05），見(jiàn)表4。

表4 過(guò)表達(dá)LINC00461對(duì)益母草堿作用的SiHa細(xì)胞凋亡的影響. n = 9Tab 4 Effect of over-expression of LINC00461 on the apoptosis of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

3 討論

益母草中包含生物堿、酚酸、二萜和黃酮類化合物，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)神經(jīng)、心臟和子宮的作用[6]。益母草根提取物能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[7]。益母草乙醇提取物以劑量和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[8]。益母草提取物可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，益母草沖劑可增強(qiáng)Ⅲ～Ⅳ期宮頸癌單純放療患者的療效[9-10]。益母草堿是從益母草中提取的生物堿，本研究旨在評(píng)價(jià)益母草堿對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞的存活、克隆形成均具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性。Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生的執(zhí)行因子，研究表明Caspase-3表達(dá)與宮頸癌癌灶體積呈負(fù)相關(guān)，提高Caspase-3表達(dá)能夠縮小癌灶體積[11]。p21通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白激酶復(fù)合物的活性，抑制DNA復(fù)制和修復(fù)，阻礙細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，具有抑癌作用[12]。本研究顯示，益母草堿呈劑量依賴關(guān)系提高p21和Caspase-3表達(dá)，與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。以上結(jié)果表明，益母草堿能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

lncRNAs由長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA組成，與細(xì)胞周期、增殖、生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程密切相關(guān)[12]。研究表明，LINC00461高表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者低生存率有關(guān)[13]。LINC00461高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14-17]。LINC00461高表達(dá)可能是肺癌細(xì)胞放療抵抗和結(jié)直腸癌順鉑耐藥的重要原因[18-19]。為進(jìn)一步探討益母草堿對(duì)宮頸癌的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞LINC00461表達(dá)的影響，結(jié)果顯示30 μg·mL-1益母草堿可降低SiHa細(xì)胞LINC00461表達(dá)水平，提示益母草堿的抗宮頸癌作用可能與抑制LINC00461表達(dá)有關(guān)。過(guò)表達(dá)LINC00461后，SiHa細(xì)胞存活率、克隆形成能力增加，細(xì)胞凋亡率降低，說(shuō)明LINC00461在宮頸癌中具有致癌作用。此外，過(guò)表達(dá)LINC00461還可逆轉(zhuǎn)益母草堿對(duì)SiHa細(xì)胞存活、克隆形成、凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，這進(jìn)一步說(shuō)明益母草堿通過(guò)抑制LINC00461發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上，益母草堿通過(guò)抑制LINC00461能夠抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為益母草堿在宮頸癌治療中的應(yīng)用提供了理論支持。本實(shí)驗(yàn)也存在局限性，研究著重體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，關(guān)于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。