鄧 婷，黨 斌，張文剛，遲 明， 楊希娟

（1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016；2.青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016；3.青海省輕工業(yè)研究所有限公司，青海西寧 810001）

青稞是禾本科大麥屬大麥栽培的變種，俗稱(chēng)裸大麥[1]，是青藏高原特有農(nóng)作物，生長(zhǎng)在海拔4 000 多m的青藏高原，是我國(guó)高寒農(nóng)業(yè)區(qū)主要糧食作物，也是藏族群眾賴(lài)以生存的基本口糧[2-4]。青稞相比一般谷物具有“三高兩低”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（如高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖），且富含β -葡聚糖、多酚、淀粉等活性成分[5-7]。目前，青稞營(yíng)養(yǎng)組分的研究多關(guān)注淀粉[8]、β -葡聚糖[9]、多酚[10]等活性成分，對(duì)于青稞蛋白的研究相對(duì)較少。

青稞中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸配比合理，蛋白質(zhì)平均含量約13.08%[11]，是水稻的2 倍，是高粱和玉米的1.5 倍[12]，極具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。目前，關(guān)于青稞蛋白的研究主要集中于青稞分離蛋白的提取工藝優(yōu)化及功能性質(zhì)研究[13-14]、蛋白酶解多肽的制備[15]等方面，而關(guān)于青稞組分蛋白的研究較少。根據(jù)溶解度的不同，青稞蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白4 種組分。已有研究報(bào)道了不同品種青稞中4 種組分蛋白的含量[16]，但是其提取方法均是按照小麥組分蛋白的方法進(jìn)行的。雖然青稞和小麥中均含有以上4 種蛋白組分，但是其含量、分子量大小存在明顯差異[17]。因此，優(yōu)化比較傳統(tǒng)Osborne 提取方法與超聲波法提取青稞中組分蛋白的工藝，旨在探尋一種適合青稞中組分蛋白的提取方法。以期為青稞品質(zhì)的功能評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，同時(shí)為青稞蛋白的深度開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青稞（西寧昆侖15 號(hào)），青海省農(nóng)林科學(xué)院作物所提供。

無(wú)水乙醇、磷酸、過(guò)硫酸銨，均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；考馬斯亮藍(lán)（G250、R250）、牛血清蛋白、電泳制膠液、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、甘氨酸、四甲基乙二胺（TEMED）、蛋白Marker（11-245 kDa）均為生化試劑，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

AL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；DL-5M 型低速冷凍離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；N4S 型紫外線可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-6D 型電腦三恒多用電泳儀電源、DYCZ-30C 型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；PD-A 型X線膠片觀察燈，汕頭市粵華醫(yī)療器械廠有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組分蛋白提取率的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法（G250 顯色法）測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[18]，以吸光度A 為縱坐標(biāo)（Y），牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為Y=5.74X+0.019 3（R2=0.998 3）。按以下公式計(jì)算組分蛋白提取率：

式中：X——蛋白提取率，%；

C——提取液蛋白溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m—樣品中蛋白含量，g。

1.2.2 傳統(tǒng)Osborne 法提取青稞各組分蛋白

（1）提取流程。青稞全籽粒粉碎后即為試驗(yàn)樣品。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 樣品于50 mL 離心管中，按設(shè)定的料液比加入去離子水，攪拌均勻，在一定溫度下，恒溫水浴振蕩浸提，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min得到上清液A 和殘?jiān)麬，收集上清液A，即為清蛋白提取液；殘?jiān)麬 中加入NaCl 溶液，重復(fù)上述提取步驟，得到上清液B 和殘?jiān)麭，收集上清液B，即為球蛋白提取液；依次向殘?jiān)麭 中加入乙醇溶液，提取醇溶蛋白，即得到上清液C 和殘?jiān)麮，再向殘?jiān)麮中加入NaOH 溶液提取谷蛋白，重復(fù)上述操作即得上清液D 和殘?jiān)麯；按照1.2.1 所述方法計(jì)算各組分蛋白提取率。

（2）正交試驗(yàn)方法。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以蛋白提取率為指標(biāo)，選取提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。

傳統(tǒng)Osborne 法提取組分蛋白正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 傳統(tǒng)Osborne 法提取組分蛋白正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 超聲波提取青稞各組分蛋白工藝

（1）提取流程。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 樣品于50 mL 離心管中，按料液比1∶16 加入去離子水，攪拌均勻，設(shè)置超聲波清洗機(jī)功率250 W，溫度50 ℃，浸提30 min后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，上清液即為清蛋白提取液；再向提取過(guò)清蛋白的殘?jiān)邪戳弦罕?∶14 加入5% NaCl 溶液，在超聲功率300 W，溫度30 ℃，超聲時(shí)間40 min 條件下提取并離心得球蛋白提取液；依次向球蛋白提取液殘?jiān)屑尤?5%乙醇溶液，在料液比1∶12，超聲功率300 W，溫度35 ℃，超聲時(shí)間50 min 條件下提取并離心得到醇溶蛋白提取液；再向提取過(guò)醇溶蛋白的殘?jiān)邪戳弦罕?∶16加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的NaOH 溶液，在超聲功率450 W，溫度55 ℃，超聲時(shí)間45 min 條件下提取并離心得谷蛋白提取液。

（2）正交試驗(yàn)方法。以蛋白提取率為指標(biāo)，選取料液比（A'）、超聲功率（B'）、提取溫度（C'）、超聲時(shí)間（D'）為因素，固定NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%，設(shè)計(jì)L9（34）水平正交試驗(yàn)。

超聲波提取組分蛋白正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 超聲波提取組分蛋白正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 組分蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

參考孫媛等人[19]的方法，將提取的青稞各組分蛋白上清液，等量分別取7 份各5 mL 上清液于10 mL離心管中，用濃度0.1 mol/L HCl 溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，靜置離心后取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)樣品于波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度，吸光度越小，說(shuō)明上清液中蛋白質(zhì)含量越低，對(duì)應(yīng)的pH 值即為等電點(diǎn)。

1.2.5 青稞組分蛋白分子量分布的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

參考張文剛等人[20]的方法稍作調(diào)整，采用蛋白質(zhì)凝膠電泳（SDS-PAGE）來(lái)分析青稞不同組分蛋白的分子量分布。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠為4%，取40 μL 青稞組分蛋白提取液加入160 μL 上樣緩沖液（變性電泳組含5%巰基乙醇），沸水浴5 min。取15 μL 處理后的樣品上樣后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將分離凝膠置于含有0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250 的染色液中染色1 h，再用含有甲醇-乙酸的水溶液進(jìn)行脫色，在X 線膠片觀察燈下觀察條帶。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，運(yùn)用Excel 和Origin 2019b 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 傳統(tǒng)Osborne 法提取青稞組分蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

（1）清蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

清蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，清蛋白提取方差分析見(jiàn)表4。

表3 清蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 清蛋白提取方差分析

由表3 可知，各因素對(duì)清蛋白Osborne 法提取率的影響依次為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B3C3。由表4 可知，提取溫度為顯著因素，料液比和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶14，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間80 min。在該最優(yōu)條件下提取率達(dá)到41.79%，高于正交試驗(yàn)中所有組合。

（2）球蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

球蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，球蛋白提取方差分析見(jiàn)表6。

由表5 可知，各因素對(duì)球蛋白傳統(tǒng)Osborne 法提取率的影響依次為料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最優(yōu)組合為A1B3C3D3。由表6 可知，提取時(shí)間和料液比為顯著因素，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶14，提取時(shí)間80 min，提取溫度45 ℃，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，此最優(yōu)條件下球蛋白提取率達(dá)到36.72%。

表5 球蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 球蛋白提取方差分析

（3）醇溶蛋白提取最佳工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

醇溶蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表7，醇溶蛋白提取方差分析見(jiàn)表8。

表7 醇溶蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表8 醇溶蛋白提取方差分析

由表7 可知，各因素對(duì)醇溶蛋白傳統(tǒng)Osborne 法提取率的影響依次為提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間，最優(yōu)組合為A1B3C3D3。由表8 可知，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)為顯著因素，料液比和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶12，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間80 min，此最優(yōu)條件下醇溶蛋白提取率達(dá)到25.81%。

（4）谷蛋白提取最佳工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

谷蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表9，谷蛋白提取方差分析見(jiàn)表10。

表9 谷蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表10 谷蛋白提取方差分析

由表9 可知，各因素對(duì)谷蛋白傳統(tǒng)Osborne 法提取率的影響依次為料液比＞NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B3C3D2。由表10 方差分析可知，NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比為顯著因素，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16，NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間120 min，在此最優(yōu)條件下提取率達(dá)到89.21%。

2.1.2 超聲波提取青稞組分蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

（1）清蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

清蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表11，清蛋白提取方差分析見(jiàn)表12。

由表11 可知，各因素對(duì)清蛋白超聲法提取率的影響為料液比＞提取溫度＞超聲時(shí)間＞超聲功率，最優(yōu)組合為由表12 可知，料液比為顯著因素，超聲功率、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶14，提取溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲功率250 W，在此最優(yōu)條件下提取率達(dá)到60.13%。

表11 清蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表12 清蛋白提取方差分析

（2）球蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

球蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表13，球蛋白提取方差分析見(jiàn)表14。

表13 球蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表14 球蛋白提取方差分析

由表13 可知，各因素對(duì)球蛋白超聲法提取率的影響依次為超聲功率＞提取溫度＞超聲時(shí)間＞料液比，最優(yōu)組合為A''2B''2C''1D''2。由表14 可知，超聲功率、提取溫度為顯著因素，料液比和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶14，超聲功率300 W，提取溫度25 ℃，超聲時(shí)間40 min，在此最優(yōu)條件下提取率達(dá)到49.82%。

（3）醇溶蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

醇溶蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表15，醇溶蛋白提取方差分析見(jiàn)表16。

表15 醇溶蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表16 醇溶蛋白提取方差分析

由表15 可知，各因素對(duì)醇溶蛋白超聲法提取率的影響依次為料液比＞提取溫度＞超聲功率＞超聲時(shí)間，最優(yōu)組合為A'''3B'''1C'''3D'''1。由表16 方差分析可知，料液比和提取溫度為顯著因素，超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶14，超聲功率300 W，提取溫度35 ℃，超聲時(shí)間45 min，在此最優(yōu)條件下提取率達(dá)到48.18%。

（4）谷蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果。

谷蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)見(jiàn)表17，谷蛋白提取方差分析見(jiàn)表18。

由表17 可知，各因素對(duì)谷蛋白超聲法提取率的影響依次為料液比＞超聲功率＞提取溫度＞超聲時(shí)間，最優(yōu)組合為A''''3B''''3C''''3D''''2。由表18 可知，料液比為顯著因素，超聲功率、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16，超聲功率450 W，提取溫度55 ℃，超聲時(shí)間40 min，在此最優(yōu)條件下提取率達(dá)到97.63%。

表17 谷蛋白提取工藝參數(shù)正交試驗(yàn)

表18 谷蛋白提取方差分析

2.2 青稞組分蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

青稞組分蛋白等電點(diǎn)見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，4 種青稞蛋白質(zhì)在不同pH 值下的吸光度存在差異。醇溶蛋白和谷蛋白在pH 值2.0～4.0 吸光度呈下降趨勢(shì)，而清蛋白和球蛋白吸光度在該pH 值范圍內(nèi)有所波動(dòng)且總體變化相反，當(dāng)pH 值高于4.0 后4 種青稞蛋白質(zhì)的吸光度均有明顯增大趨勢(shì)，上述結(jié)果與孫媛[21]關(guān)于小麥4 種蛋白分離分級(jí)的報(bào)道相類(lèi)似。當(dāng)pH 值分別為2.5，3.5，4.0 和4.0 時(shí)清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白溶液吸光度最小，各蛋白質(zhì)形成的沉淀最多，推測(cè)上述pH 值即為青稞不同組分蛋白的等電點(diǎn)。溶液中蛋白質(zhì)以?xún)捎H性離子形式存在，在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)蛋白顆粒帶同種電荷較多，顆粒之間靜電斥力強(qiáng)，不易聚集沉淀，溶解度較高；但在等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒凈電荷趨于0，顆粒之間相互作用力小，易于聚集沉淀，導(dǎo)致溶解度顯著降低。

圖1 青稞組分蛋白等電點(diǎn)

2.3 2 種提取方法蛋白提取率比較及SDS-PAGE 電泳圖譜

2.3.1 2 種提取方法蛋白提取率比較

2 種提取方法不同組分蛋白提取率比較見(jiàn)表19。

表19 2 種提取方法不同組分蛋白提取率比較

由表19 可知，超聲波提取能顯著提高青稞不同組分蛋白的提取率，相比傳統(tǒng)Osborne 提取法而言，提取率分別提高了約19.94%（清蛋白），11.81%（球蛋白），16.6%（醇溶蛋白），7.92%（谷蛋白），且極大縮短了各組分蛋白的提取時(shí)間，其中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白提取時(shí)間分別縮短了50，40，30，75 min。李茉等人[22]采用超聲波法提取辣椒籽蛋白，與傳統(tǒng)提取法相比蛋白提取量增加了0.81 g/100 g；張兆云等人[23]采用超聲波輔助 提取藜麥清蛋白，發(fā)現(xiàn)提取率增大至40.1%，即超聲處理可以有效提高蛋白提取率，與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。Ahmed Taha 等人[24]研究了超聲波提取對(duì)核桃不同組分蛋白提取率和理化性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波極大地提高了核桃組分蛋白提取率并有效改善其功能性質(zhì)。超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)和攪拌作用可以破壞植物的細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的溶出速率和溶出量增大，從而顯著提升植物蛋白的提取效率。

2.3.2 青稞不同組分蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜

不同提取方法下青稞組分蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取方法下青稞組分蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜

由圖2 可知，4 種蛋白的亞基分布主要集中在11～75 kDa。清蛋白亞基主要集中在11～66 kDa；球蛋白主要集中在12～63 kDa；醇溶蛋白條帶細(xì)少，主要分布在32～55 kDa 和小于15 kDa；谷蛋白亞基條帶最少，主要分布在37～50 kDa 和70 kDa。超聲提取青稞蛋白的條帶清晰且各亞基分離較好，說(shuō)明所得蛋白含量和純度相對(duì)較高[25]。2 種提取方法下蛋白的亞基數(shù)量和含量有明顯差別，超聲法提取的各蛋白亞基條帶均多于傳統(tǒng)Osborne 法。相較而言，傳統(tǒng)Osborne 法提取的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別在分子量30～48 kDa，28～32 kDa，30 kDa 和35～48 kDa/75 kDa 存在條帶缺失。在分子量低于40 kDa區(qū)域，傳統(tǒng)Osborne 法所得蛋白亞基條帶較少，可能原因是水浴提取所需的溫度較高，蛋白存在一定程度的損失和降解，同時(shí)該區(qū)域蛋白亞基條帶顏色淺且模糊，可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)和小分子等活性物質(zhì)發(fā)生了相互作用[26]。張舒等人[27]通過(guò)2 種不同處理提取出綠豆蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，綠豆蛋白亞基條帶均變淺，且有不同分子質(zhì)量的亞基條帶逐漸消失，這與本試驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似。綜上，超聲波法提取蛋白的含量更高且組成更豐富，可以更好地分離出青稞高分量組分蛋白。

3 結(jié)論

優(yōu)化了傳統(tǒng)Osborne 法和超聲波法提取青稞4 種蛋白的工藝，并比較了2 種方法的提取性能。在最佳條件下，2 種方法均能有效提取青稞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，且4 種蛋白的等電點(diǎn)分別為2.5，3.5，4.0，pH 值4.0。超聲波提取法制備的不同蛋白含量和純度更高、組成更豐富，包含的大分子量蛋白更多。相比傳統(tǒng)Osborne 提取法，超聲提取法可以顯著提升蛋白的提取效率，縮短提取時(shí)間，可作為青稞組分蛋白的良好提取技術(shù)。比較分析了青稞蛋白的2 種提取工藝，對(duì)2 種方法下不同組分蛋白的理化和功能特性還需進(jìn)一步探討，以期為青稞蛋白質(zhì)的高效分離制備與應(yīng)用提供理論支撐。