徐倩倩，關(guān)捷心，康唐穎，塔西亞·阿布都沙拉木，趙延勝

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

咖啡以獨(dú)特的風(fēng)味及其抗疲勞、提神的功能而受到消費(fèi)者的廣泛歡迎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球咖啡的年產(chǎn)量近千萬(wàn)噸，世界咖啡消耗量比可可和茶葉大1 倍多，且仍以每年1.5 倍的速度增長(zhǎng)[1]。而在咖啡飲品加工制備過程中會(huì)產(chǎn)生大量的咖啡渣，在咖啡烹煮過程中，用于飲用的物質(zhì)量?jī)H占咖啡總物質(zhì)含量的0.2%，剩余的咖啡渣中仍含有大量營(yíng)養(yǎng)、功能及風(fēng)味物質(zhì)[2]。目前，國(guó)內(nèi)外的咖啡渣主要用作肥料和燃料處理，其二次利用的附加值不高，有的甚至作為廢棄物直接丟棄，既浪費(fèi)了大量資源，也為生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了不利的影響[3-4]。目前，對(duì)于咖啡渣中有效成分的研究一般多集中于單一組分的提取，如提取其中的多糖、多酚等物質(zhì)，而采用微生物發(fā)酵的方式處理咖啡渣，進(jìn)行食品或飲品開發(fā)等方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。

已有研究表明，咖啡及其相關(guān)副產(chǎn)物可以作為乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅能夠轉(zhuǎn)化咖啡渣中的營(yíng)養(yǎng)成分，且發(fā)酵過程有利于特征風(fēng)味的形成。董紅紅等人[5]對(duì)云南小?？Х葷穹òl(fā)酵體系中的pH 值和8 種有機(jī)酸的含量變化進(jìn)行了測(cè)定，并分離鑒定了發(fā)酵過程中的細(xì)菌種類。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中，pH 值變化整體呈下降趨勢(shì)，且存在大量產(chǎn)果膠酶的細(xì)菌。魏敏等人[6]研究了桑腸桿菌發(fā)酵對(duì)咖啡提取物揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果表明咖啡提取物經(jīng)微生物發(fā)酵后香氣成分改變大，具有咖啡特征香氣的同時(shí)，帶有濃郁堅(jiān)果奶香等豐富香氣，刺激性成分和苦澀感減少，香氣品質(zhì)提高。因此，以咖啡渣為研究對(duì)象，采用植物乳桿菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵處理，研究植物乳桿菌的生物轉(zhuǎn)化作用對(duì)咖啡渣主要營(yíng)養(yǎng)活性成分及其揮發(fā)性物質(zhì)的影響，以期為進(jìn)一步開展咖啡渣的生物加工及其產(chǎn)品開發(fā)提供一定的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ME802E 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPX-250B-G 型微電腦光照培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；全自動(dòng)滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；ZQTY-70N 型恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；7200 型可見光分光光度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；BR4-I 型冷凍離心機(jī)，法國(guó)JOUAN 公司產(chǎn)品；TQ8040 型氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備有自動(dòng)頂空固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)，日本島津公司產(chǎn)品。

菌種：植物乳桿菌：Lactobacillus plantarum dy-1（CGMCC NO.6016，下文縮寫為L(zhǎng).plantarum dy-1），由實(shí)驗(yàn)室自行分離；咖啡渣，鎮(zhèn)江樂顏咖啡提供；白砂糖等其他食品配料，購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校琋aOH、福林酚等試劑，國(guó)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供；蛋白測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 樣品制備及分析方法

1.2.1 咖啡渣發(fā)酵樣品制備方法

（1）植物乳桿菌活化擴(kuò)培。將1×107CFU/mL 的L.plantarum dy-1 活化2 次使活菌數(shù)達(dá)到1×109CFU/mL（34 ℃培養(yǎng)24 h）。將培養(yǎng)好的乳酸菌以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加入上清液等體積的蒸餾水，混合均勻，待發(fā)酵使用。

（2）咖啡渣發(fā)酵樣品的制備。參照課題組之前的方法進(jìn)行發(fā)酵樣品處理[7]，將咖啡渣烘干后，稱取20 g，按1∶7 比例加入蒸餾水，將咖啡渣（W）∶水（V）∶植物乳桿菌（%）按一定比例于錐形瓶中混合均勻，用紗布將錐形瓶封口，于31 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 恒溫發(fā)酵，發(fā)酵后的樣品以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心20 min 后，取上清液對(duì)其進(jìn)行成分分析。

1.2.2 咖啡渣發(fā)酵產(chǎn)物主要營(yíng)養(yǎng)活性成分分析方法

發(fā)酵產(chǎn)物中的總酚含量測(cè)定采用福林酚法[8]，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品作參照，發(fā)酵樣品經(jīng)稀釋后取1 mL，加入5 mL 蒸餾水、75%N2CO3溶液3 mL 和福林酚溶液1 mL，將上述試劑在水浴45 ℃下反應(yīng)1.5 h 后，測(cè)定波長(zhǎng)765 nm 處吸光度。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.003 6X+0.017，R2=0.993 4），計(jì)算樣品中總酚含量。

根據(jù)試劑盒說明書，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)量濃度，用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物于595 nm 處吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mg/mL）得標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.685 8X+0.006 9，R2=0.988 1），計(jì)算未知樣品中的蛋白質(zhì)量濃度。

1.2.3 咖啡渣發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分分析方法

固相微萃取條件在李信等人[9]方法的基礎(chǔ)上調(diào)整：準(zhǔn)確稱取5.0 g 樣品和1.5 g 氯化鈉至頂空瓶，放入自動(dòng)樣品盤中，40 ℃平衡1 min 后，40 ℃自動(dòng)固相微萃取20 min，并進(jìn)樣至GC/MS 分析。氣相色譜分析條件：進(jìn)樣口溫度250℃，萃取頭進(jìn)樣后解析5 min，載氣為高純氦，載氣流速為1 mL/min，毛細(xì)管氣相色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫條件如下：40 ℃維持2 min，5 ℃/min 速率升溫至200 ℃，10 ℃/min 速率升溫至240 ℃后，維持5 min。質(zhì)譜分析條件：離子源為EI 源，溫度230 ℃，能量70 eV，掃描模式為全掃描模式，掃描質(zhì)量數(shù)范圍為35～450。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

樣品中主要成分測(cè)定結(jié)果采用GraphPad Prism 7.0 繪制并進(jìn)行顯著性分析，采用MetaboAnalyst 4.0處理GC/MS 包含化合物及其峰面積數(shù)據(jù)，并使用Microsoft Excel 2019 重新繪制導(dǎo)出的結(jié)果分析圖，其中，以-1～1 的化合物標(biāo)準(zhǔn)值繪制熱圖，反映發(fā)酵過程中的相對(duì)含量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)咖啡渣主要成分的影響

植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中總酚（a）及蛋白質(zhì)量濃度（b）分析結(jié)果見圖1。

圖1 植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中總酚（a）及蛋白質(zhì)量濃度（b）分析結(jié)果

結(jié)合pH 值監(jiān)測(cè)分析，單獨(dú)添加植物乳桿菌后，B 組樣品的pH 值并無(wú)顯著變化，說明在不添加額外碳源的條件下，咖啡渣無(wú)法提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分供植物乳桿菌發(fā)酵，但由圖1 可知，B 組樣品產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)量濃度有所提升（圖1（b）），說明在樣品處理過程中，仍有部分微生物發(fā)酵作用，包括植物乳桿菌初始的發(fā)酵，以及咖啡渣中可能存在的微生物自然發(fā)酵，促進(jìn)了咖啡渣中蛋白的溶出；但總酚質(zhì)量濃度顯著降低（圖1（a）），說明在B 組處理過程中，相關(guān)的發(fā)酵作用對(duì)酚類物質(zhì)可能存在利用或者轉(zhuǎn)化等作用，導(dǎo)致酚類物質(zhì)減少，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

通過補(bǔ)充蔗糖作為碳源，植物乳桿菌發(fā)酵作用明顯，主要體現(xiàn)在發(fā)酵后pH 值顯著降低，發(fā)酵產(chǎn)物的pH 值為4.3，并且由圖1 可知，總酚及蛋白質(zhì)量濃度均顯著增加，說明植物乳桿菌發(fā)酵作用顯著促進(jìn)了咖啡渣中有效成分的釋放，有助于通過發(fā)酵作用實(shí)現(xiàn)咖啡渣的生物轉(zhuǎn)化及應(yīng)用。

2.2 咖啡渣的植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物主要揮發(fā)性成分分析與鑒定

氣相色譜/質(zhì)譜總離子色譜流圖見圖2。

圖2 氣相色譜/質(zhì)譜總離子色譜流圖

由圖2 可知，經(jīng)自動(dòng)固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜分析后，樣品中揮發(fā)性物質(zhì)得到較好的分離，通過Nist 17 數(shù)據(jù)庫(kù)軟件的匹配、檢索，對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行初步鑒定，定性匹配度90 以上的化合物信息如表1 所示。結(jié)果顯示，與A 組和B 組樣品相比，C 組發(fā)酵樣品中檢出有乙酸糠酯、2-乙基-3-甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪等化合物。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)咖啡渣揮發(fā)性成分的影響

將不同組樣品化合物對(duì)應(yīng)的色譜峰面積等信息進(jìn)行處理，得到數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)MetaboAnalyst 軟件歸一化處理后，進(jìn)行主成分分析。

不同處理組樣品主成分分析結(jié)果及其載荷圖見圖3。

由圖3 可知，3 組樣品得到明顯區(qū)分，說明植物乳桿菌的發(fā)酵處理顯著改變了咖啡渣樣品中的化合物組分，這與表1 中的化合物分析結(jié)果相符。

圖3 不同處理組樣品主成分分析結(jié)果及其載荷圖

咖啡渣植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表1。

對(duì)3 種不同處理組樣品中化合物及其相對(duì)含量進(jìn)行熱圖分析（見圖4），B 組樣品相對(duì)于A 組和C組，棕櫚酸、亞油酸甲酯、2,4-二甲基苯甲醛等化合物含量顯著增加，而C 組發(fā)酵樣品與A、B 組相比，乙酸糠酯、2-乙基-3-甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基-吡嗪的含量顯著增加且A、B 組未檢出，而3-乙基-2,5-甲基吡嗪、咖啡因等作為3 組樣品中共有的物質(zhì)（表1），在C 組發(fā)酵樣品中的含量得到顯著提升。

表1 咖啡渣植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性成分分析結(jié)果

3種不同處理方式咖啡渣提取物中化合物熱圖見圖4。

圖4 3 種不同處理方式咖啡渣提取物中化合物熱圖

進(jìn)一步對(duì)化合物結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘分析（PLS），根據(jù)化合物的VIP 值（Variables' importance of projection）大于1，得到發(fā)酵樣品中的特征性成分，分別為2 -乙基-3 -甲基吡嗪、3,5 -二乙基-2 -甲基-吡嗪、乙酸糠酯、咖啡因、二糠基醚、3-乙基-2,5 -甲基吡嗪等物質(zhì)。其中，2 -乙基-3 -甲基吡嗪、3,5 -二乙基-2 -甲基-吡嗪、3 -乙基-2,5-甲基吡嗪等吡嗪類化合物是堅(jiān)果、豆類等食品中的重要香氣成分[10-12]，乙酸糠酯是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的特征物質(zhì)[13-14]，而咖啡因作為咖啡產(chǎn)品中的特征物質(zhì)，二糠基醚作為咖啡豆中的主要揮發(fā)性成分[15]，均在植物乳酸菌發(fā)酵過程中得到了顯著的提升。

揮發(fā)性化合物的VIP 得分圖見圖5。

圖5 揮發(fā)性化合物的VIP 得分圖

3 結(jié)論

咖啡渣的生物加工有利于其資源的精深加工及其高值化應(yīng)用，研究采用植物乳桿菌發(fā)酵的方式處理咖啡渣樣品，結(jié)果表明，通過補(bǔ)充蔗糖作為碳源，有利于促進(jìn)植物乳桿菌的發(fā)酵及其對(duì)咖啡渣基質(zhì)的利用，發(fā)酵產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)含量及蛋白含量顯著提升，且經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，吡嗪類化合物、乙酸糠酯、咖啡因等風(fēng)味物質(zhì)的含量顯著增加，是咖啡渣發(fā)酵產(chǎn)物中的主要特征成分，為進(jìn)一步開展咖啡渣生物加工技術(shù)應(yīng)用，促進(jìn)其副產(chǎn)物的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)提供了一定的研究基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)咖啡渣等食品廢棄副產(chǎn)物資源的高值化利用。