呂玉金，艾夢燕，宋予震，周佳淑，王 聰，吳鳳筍，李文剛，彭 忠，陳煥春，王湘如

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450002；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

雞源大腸桿菌病是危害養(yǎng)雞業(yè)的常見細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率和死亡率都比較高，經(jīng)濟(jì)損失巨大。臨床上預(yù)防和治療雞源大腸桿菌感染主要依賴抗菌藥，由于抗菌藥不規(guī)范使用，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌株，造成藥物殘留問題，危害公共衛(wèi)生安全。有研究表明，大腸桿菌的毒力因子包括黏附素、攝鐵系統(tǒng)、侵襲素和血清抗性等[1]。大腸桿菌的毒力與其所攜帶毒力因子的數(shù)量具有顯著的相關(guān)性[2-4]。一般而言，大腸桿菌攜帶的毒力基因數(shù)量越多，其毒力越強(qiáng)[5]。我國大腸桿菌耐藥情況調(diào)查表明，畜禽體中所攜帶的大腸桿菌耐藥性十分嚴(yán)峻，張海龍[6]通過對河北省2018—2020年雞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株對阿莫西林、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素等藥物的耐藥率達(dá)70%以上，并呈現(xiàn)逐年增長的趨勢；徐亞亞等[7]研究發(fā)現(xiàn)，50%的大腸桿菌分離株耐受13種藥物，對強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素等抗菌藥物的耐藥率均已經(jīng)超過了80%。耐藥性菌株的出現(xiàn)，增加了致病性大腸桿菌的治療難度，因此，本試驗通過對河南省雞源大腸桿菌致病性及耐藥性進(jìn)行檢測，以期為其防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 采集河南省30個規(guī)?；B(yǎng)雞場病死雞的盲腸、肝臟、心臟等共430份樣品。

1.2 主要試劑及儀器 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB肉湯，均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；綠如藍(lán)核酸染料，購自北京天恩澤基因科技有限公司；藥敏紙片，購自北京普納德科技有限公司。恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272)，上海百典儀器有限公司；PCR儀(ETC-811)，東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；電泳儀(DYY-10C)，北京六一儀器廠。

1.3 大腸桿菌的分離純化與PCR鑒定 在無菌條件下，將采集的430份組織樣品進(jìn)行研磨處理，分別加入3 mL LB肉湯，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16～18 h，采用三區(qū)劃線法劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，挑選黑色、帶有金屬光澤、邊緣整齊、表面光滑、凸起的圓形菌落進(jìn)行純化。采用PCR擴(kuò)增16S rDNA基因的方法進(jìn)行大腸桿菌的鑒定，擴(kuò)增引物信息見表1。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 大腸桿菌16S rDNA鑒定引物

1.4 大腸桿菌毒力基因鑒定 采用參考文獻(xiàn)[8]中引物序列及多重PCR體系分別擴(kuò)增17種毒力相關(guān)基因，引物信息見表2。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表2 大腸桿菌17種毒力基因鑒定引物

1.5 大腸桿菌耐藥性檢測 采樣K-B紙片法對分離的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗，受試藥物包括頭孢哌酮(CFP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑啉(KZ)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、卡那霉素(K)、鏈霉素(S)、阿莫西林(AML)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TE)、諾氟沙星(NOR)、復(fù)方新諾明(STX)、氯霉素(C)、克林霉素(DA)、新霉素(N)、大觀霉素(SPC)、氨芐西林(AMP)、多西環(huán)素(DOX)、氧氟沙星(OFX)和恩諾沙星(ENR)共21種藥物，參照美國臨床和實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(第30版)進(jìn)行抗微生物藥物敏感結(jié)果判定。

1.6 大腸桿菌耐藥基因檢測 對大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測，包括qnrB、floR、sul3、sul2、blaNDM-1、blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、mcr-1、blaVIM、tetA、blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和cfr共15種耐藥基因，采用PCR方法進(jìn)行鑒定，引物序列、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照參考文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的PCR鑒定 分離純化后通過PCR方法擴(kuò)增16S rDNA基因，結(jié)果顯示，從430份樣品中分離鑒定出374株大腸桿菌，分離率為86.98%，見圖1。

圖1 部分大腸桿菌16S rDNA的PCR鑒定

2.2 大腸桿菌毒力基因鑒定 毒力基因的檢測結(jié)果顯示，17種待檢毒力基因中yijp、ompA、fimC、mat基因的檢出率高達(dá)90.00%以上，ibeB、iss、iroN、iucD基因的檢測率在50.00%～80.00%，aatA、tsh、cvaC、fyuA、irp2、chuA基因的檢出率在10.00%～50.00%，neuC基因的檢出率為0，其他毒力基因檢出率低于10.00%(圖2)；分析不同菌株所含毒力基因的種類，結(jié)果顯示，136株大腸桿菌分離株所含毒力基因種數(shù)在10種及以上，占比為36.36%；134株大腸桿菌分離株攜帶8～9種毒力基因，占比為 35.83%；104株大腸桿菌分離株攜帶7種及以下毒力基因，占比為27.81%(圖3)；在攜帶10種以上毒力基因的136株大腸桿菌分離株中，108株攜帶了tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2毒力基因中的3種及以上(圖4)，被界定為致病性大腸桿菌[5]。

圖2 大腸桿菌毒力基因分布情況

圖3 374株大腸桿菌攜帶17種毒力基因情況

圖4 136株大腸桿菌攜帶6種毒力基因情況

2.3 大腸桿菌耐藥性檢測 對108株致病性大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性測試和耐藥譜分析。藥敏試驗結(jié)果顯示：其中90.00%以上的分離株對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素耐藥，80.00%～90.00%的分離株對四環(huán)素、氯霉素、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明耐藥，36.11%的分離株對諾氟沙星表現(xiàn)出耐藥性(圖5)。耐藥譜分析結(jié)果顯示，其中8株致病性大腸桿菌對20種受試藥物表現(xiàn)耐藥，占比7.41%；57株致病性大腸桿菌針對15～19種受試藥物表現(xiàn)出耐藥性，占比52.78%；27株致病性大腸桿菌耐藥種數(shù)介于10～14種，占比25.00%；16株致病性大腸桿菌耐藥種數(shù)為9種及以下，占比14.81%，在這16株致病性大腸桿菌中，有13株耐藥種數(shù)在3種及以上(圖6)。

圖5 大腸桿菌對不同抗菌藥的耐藥率

圖6 大腸桿菌耐藥種數(shù)

2.4 大腸桿菌耐藥基因檢測 檢測108株致病性大腸桿菌中15種耐藥基因的攜帶情況。結(jié)果顯示：sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)這3種耐藥基因的檢出率較高，均達(dá)到了70.00%以上；blaTEM基因檢出率為51.85%；未檢測出qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr這5種耐藥基因(表3)。在檢測的15種耐藥基因中，單菌株檢出的耐藥基因種數(shù)最少為0種，有1株大腸桿菌，占比為0.93%；檢出的耐藥基因種數(shù)最多為7種，有3株大腸桿菌，占比為2.78%；其中攜帶4種耐藥基因的菌株數(shù)量最多，有27株大腸桿菌，占比為25.00%；攜帶5～6種耐藥基因的菌株占比介于15.00%～20.00%(圖7)。

表3 大腸桿菌耐藥基因檢出率

圖7 大腸桿菌攜帶耐藥基因種數(shù)

3 討論

本試驗從河南省部分養(yǎng)雞場采集430份樣品，經(jīng)細(xì)菌分離純化、PCR鑒定后共獲得374株大腸桿菌，分離率為86.98%，結(jié)果與我國其他學(xué)者的報道一致。如盧曉輝等[10]2009年報道河南省養(yǎng)雞場大腸桿菌的分離率為78.62%；毛福超等[11]2016年報道豫西地區(qū)養(yǎng)雞場大腸桿菌的分離率為75.38%；艾偉昌等[12]2018年報道河南省某規(guī)?；B(yǎng)雞場大腸桿菌的分離率為83.3%。上述結(jié)果均提示，養(yǎng)雞場中大腸桿的分離率較高，應(yīng)注意加強(qiáng)針對該病原菌的防控工作。

本試驗針對分離到的374株雞源大腸桿菌進(jìn)行毒力基因鑒定。在所檢測的17種毒力基因中，yijp、ompA、fimC、mat的檢出率高達(dá)90.00%以上，但neuC的檢出率為0；此外，超過36.36%(136/374)的大腸桿菌分離株所攜帶的毒力基因種類在10種及以上。高麗等[13]從黑龍江省大慶地區(qū)分離鑒定出的53株大腸桿菌中，48株含有毒力基因，其中氣桿菌素iucD基因占91.0%、強(qiáng)毒力島fyuA基因占51.3%、外膜蛋白o(hù)mpA基因占89.0%，而本試驗中，iucD基因占76.20%、fyuA基因占23.80%、ompA基因占95.19%。王俊麗等[8]進(jìn)行的大腸桿菌毒力基因檢測中，yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN這6種毒力基因的陽性率超過了50%，aatA、tsh、vat、cvaC、iss、iucD、irp2這7種毒力基因陽性率在20%～49%，而本試驗中，除yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN這6種基因陽性率超過50.00%，iss、iucD基因的陽性率也超過了50.00%，但本試驗vat基因的陽性率只有3.21%。王俊麗等[8]進(jìn)行的試驗中攜帶10種及以上毒力基因的比例為10%，而本試驗菌株攜帶10種及以上毒力基因占比為36.36%。張立偉等[14]分離的雞源大腸桿菌的fimC和ompA基因的攜帶率為100%，aatA、yijP、irp2、mat、iss等基因的檢出率也達(dá)到了90%以上，本試驗中yijp、ompA、fimC、mat基因的檢出率在90.00%以上，而aatA、irp2、iss這3種基因的檢出率與其不一致。綜上所述，大腸桿菌在不同地區(qū)之間的差異較大。雞源大腸桿菌攜帶的毒力基因的數(shù)量與其致病性呈正相關(guān)，當(dāng)菌株中攜帶tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2這6種毒力基因中的3種及以上時為致病性大腸桿菌[2,5]?；诖藞蟮?，本試驗中共有108株分離株可被界定為致病性大腸桿菌。

針對108株致病性大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果顯示，90.00%以上的致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素這3種抗菌藥耐藥，有8株大腸桿菌的耐藥種類均達(dá)到了20種。2010年，李昆明等[15]對分離出的雞源大腸桿菌進(jìn)行24種抗菌藥的耐藥情況檢測，其中鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素等10種藥物的耐藥率達(dá)90%，且有21種抗菌藥的耐藥率大于70%；2016年，毛福超等[11]從豫西地區(qū)養(yǎng)雞場分離得到的大腸桿菌，對20種抗菌藥的耐藥性的檢測結(jié)果顯示，分離的大腸桿菌對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氨芐西林這3種抗菌藥的耐藥率依次遞減，20種抗菌藥中耐藥最多的大腸桿菌有18種耐藥，9～14種耐藥占77.55%；2018年，艾偉昌等[12]從河南省某規(guī)?；B(yǎng)雞場分離得到的大腸桿菌，對四環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明等抗菌藥耐藥嚴(yán)重，耐藥率均在80%以上，對20種藥物產(chǎn)生耐藥的菌株占7.41%，對15～19種藥物產(chǎn)生耐藥的菌株占52.78%。

本試驗對分離出的108株致病性大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因的檢測，發(fā)現(xiàn)sul2、tetA、blaCTX-M這3種耐藥基因檢出率分別為87.04%、87.96%、75.93%，blaTEM檢出率為51.85%，qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr這5種耐藥基因檢出率為0，幾乎所有的菌株都含有2種以上的耐藥基因，有的菌株含高達(dá)7種耐藥基因。此次試驗中磺胺類耐藥基因sul2、四環(huán)素類耐藥基因tetA、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCTX-M與其相對應(yīng)的耐藥表型結(jié)果一致，但氯霉素類耐藥基因floR與其耐藥表型不一致，主要原因在于floR基因主要介導(dǎo)氟苯尼考的耐藥機(jī)制，而氯霉素的耐藥機(jī)制由cat基因介導(dǎo)。

本試驗從河南省30個規(guī)?；u場分離出374株大腸桿菌，其中108株大腸桿菌所含毒力基因種類在10種及10種以上，且其攜帶tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2這6種基因中的3種及以上，因此判定為致病性大腸桿菌。108株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素3種抗菌藥的耐藥率達(dá)90.00%以上。在耐藥基因檢測中，sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)這3種耐藥基因檢出率較高，且與其相對應(yīng)的耐藥表型結(jié)果一致。由此可見，大腸桿菌的耐藥問題較為嚴(yán)重，篩選替抗產(chǎn)品應(yīng)用于雞源大腸桿菌病的防治尤為重要，本試驗對于了解河南地區(qū)雞源大腸桿菌的流行及耐藥性具有一定的參考價值。