李宗憲， 李寄仟， 徐偉江, 2， 范麗仙, 2*

(1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650500； 2. 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明650500)

黑斑蛙重盤吸蟲隸屬復(fù)殖亞綱Digenea同盤總科Paramphistomoidea Fischoeder, 1901重盤科Diplodiscidae Cohn, 1904重盤屬Diesing, 1836。汪溥欽(1977)首次于黑斑蛙消化道中檢獲并命名為黑斑蛙重盤吸蟲，高利賓(2007)在澤蛙腸道內(nèi)也記錄了該種吸蟲自然寄生。黑斑蛙重盤吸蟲主要于江西、福建等地被報(bào)道，迄今僅見形態(tài)分類學(xué)研究(高利賓，2007；周慶安，2013)。

復(fù)殖吸蟲系統(tǒng)發(fā)育研究大多基于核基因小分子片段(18S、28S和ITS 1-5.8S-ITS 2 rDNA聯(lián)合序列)和線粒體(Littlewood & Olson，2001；Razo-Mendivil.，2004，2006；Laidemitt.，2017；丁健等，2018；李寄仟等，2020)。這些分子標(biāo)記較短、所含信息量難以全面呈現(xiàn)物種各分類階元的關(guān)系。扁形動(dòng)物的線粒體DNA進(jìn)化速率是核基因單拷貝速率的5～10倍，相比單基因承載了更多的信息量，比任何1個(gè)相對較短的DNA序列具有更多、更廣泛的特征(Boore，1999；Arnason.，2007；張娟，2011；Locke.，2018)。因此，線粒體基因組已被用作物種的準(zhǔn)確鑒定依據(jù)，基于線粒體基因組對吸蟲的系統(tǒng)學(xué)研究表明，線粒體基因組對研究吸蟲的種間和種內(nèi)變異具有更高可信度，在分子診斷學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、基因進(jìn)化和物種進(jìn)化等方面也體現(xiàn)較大潛力(Le.，2002；Littlewood，2008；Hegedusova.，2014；Ma.，2015，2017；聶宗恒等，2018；許姝歆等，2019)。

本文首次報(bào)道了重盤科吸蟲線粒體基因組，補(bǔ)充了該類吸蟲的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并揭示了其線粒體基因組特征，為后續(xù)開展基于線粒體基因組學(xué)的流行病學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究提供新的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 吸蟲的采集

宿主滇蛙捕獲于云南省曲靖市陸良縣寨子山(103°30′2.81″E，25°3′54.66″N，海拔1 958 m)。將宿主雙毀髓處死，收集消化道內(nèi)的吸蟲，部分做成裝片。

1.2 DNA的提取與線粒體基因組的獲取

根據(jù)D3399-01石蠟DNA試劑盒說明書步驟提取總DNA。線粒體基因組由北京擎科生物科技有限公司通過二代測序獲得，包括構(gòu)建文庫、測序、clean reads、組裝和比對等流程。

1.3 線粒體基因組注釋和數(shù)據(jù)分析

tRNA通過ARWEN(Laslett & Canbck，2008)和tRNAscan-SE 2.0(Lowe & Chan，2016)注釋，蛋白編碼基因和rRNA通過Mitos(Brent.，2013)注釋。采用PhyloSuite(Zhang.，2020)計(jì)算密碼子使用、同義密碼子相對使用度，使用R語言ggplot2(Wilkinson，2011)可視化。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究黑斑蛙重盤吸蟲在同盤總科的系統(tǒng)發(fā)育地位，從NCBI下載同盤總科吸蟲以及與其親緣關(guān)系較近的棘口總科Echinostomatoidea吸蟲：(KF475773)、(NC023095)、(KP341657)、(KM397348)、(KM400624)、(MH393928)、(MN116706)、(KR062182)、(AF216697)和(MH621335)，并選取(AF215860)為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用PhyloSuite(Zhang.，2020)完成對12個(gè)蛋白編碼基因的提取、比對、修剪、串聯(lián)、數(shù)據(jù)分區(qū)、模型選擇和構(gòu)建貝葉斯(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹，之后導(dǎo)入iTOL(Letunic & Bork，2021)編輯和美化。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

蟲體前端狹小，中部膨大，后端圓鈍，呈紡錘形?？谖P較小，其后有1對口支囊。食道存在。腹吸盤位于體末端，中央盤狀突起存在。食管球明顯。兩腸支長而寬大，具有5～10個(gè)彎曲，延伸至腹吸盤的前緣。睪丸光滑，位于蟲體中段。陰莖囊呈帶狀。生殖孔位于腸分叉之后。卵巢位于睪丸后，偏右側(cè)，類圓形。子宮環(huán)分布于兩腸之間，含少數(shù)蟲卵。卵黃腺呈濾泡團(tuán)塊狀，在腸支內(nèi)外側(cè)或與其重疊。排泄囊位于腹吸盤背側(cè)，開孔于腹吸盤水平的前緣。根據(jù)上述形態(tài)特征確定所采集樣本為黑斑蛙重盤吸蟲。

2.2 線粒體基因組特征和核苷酸的使用

黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組序列全長 14 697 bp(GenBank登錄號：MW698822)，由22個(gè)tRNA基因、12個(gè)蛋白編碼基因(～、、～、、)、2個(gè)rRNA基因和1個(gè)非編碼區(qū)組成。各基因間有1～33 bp的基因間隔序列或無基因間隔序列的情況下彼此相鄰或重疊1～41 bp(圖1；表1)?；蚪M序列A、T、G、C含量分別為19.3%、40.7%、28.5%、11.5%，其中，蛋白編碼基因的AT含量為59.7%，與線粒體全基因組的AT含量(60.0%)接近；基因的AT含量最高(65.2%)；基因的AT含量最低(57.1%)。

表1 黑斑蛙重盤吸蟲Diplodiscus nigromaculati線粒體基因注釋Table 1 Gene annotation of the mitochondrial genomes of Diplodiscus nigromaculati

圖1 黑斑蛙重盤吸蟲Diplodiscus nigromaculati線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Mitochondrial genome structure of Diplodiscus nigromaculati

2.3 蛋白編碼基因和密碼子的使用

黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組序列的蛋白編碼基因總長10 107 bp，包含了3 357個(gè)氨基酸。每個(gè)蛋白編碼基因和密碼子(123位)都呈現(xiàn)了較高的AT偏倚性。蛋白編碼基因有2種起始密碼子：ATG和GTG，2種終止密碼子：TAA和TAG，且大多數(shù)蛋白編碼基因的起始密碼子為ATG。

在蛋白編碼基因中最多使用的氨基酸是亮氨酸(Leu1：3.04%和Leu2：13.52%)、纈氨酸(Val：13.82%)和絲氨酸(Ser1：5.42%和Ser2：5.27%)(圖2)。在蛋白編碼基因的密碼子家族中使用最多的密碼子是UUG(319)和UUU(310)，最少的是ACC(4)和CUC(5)。

圖2 黑斑蛙重盤吸蟲Diplodiscus nigromaculati線粒體基因組蛋白編碼基因同義密碼子相對使用度Fig. 2 Relative synonymous codon usage of Diplodiscus nigromaculati mitogenome

2.4 tRNA與rRNA

黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組全序列共發(fā)現(xiàn) 22個(gè)tRNA基因，長度為57～72 bp；除基因和基因外，其他基因都呈傳統(tǒng)的三葉草結(jié)構(gòu)；基因缺失DHU臂；基因缺失TΨC臂，這一結(jié)構(gòu)特征在已發(fā)表的復(fù)殖吸蟲線粒體基因組 tRNA結(jié)構(gòu)中未見。除基因和基因外，其他基因的反密碼子起始都是T或G。

基因(16S)和基因(12S)分別長 1 057 bp 和730 bp，位于基因和基因之間，僅通過1個(gè)基因分隔開。這一排列特征與已報(bào)道復(fù)殖吸蟲線粒體基因組一致。

2.5 非編碼區(qū)

黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組的非編碼區(qū)位于基因和基因之間，長1 042 bp，其余為1～33 bp較短的基因間隔序列。非編碼區(qū)的AT含量為64.2%，與編碼區(qū)的AT含量相近。在非編碼區(qū)中通過人工比對，發(fā)現(xiàn)了2條重復(fù)序列，每條為112 bp，分別位于13 945～14 056和14 305～14 416；因其未相鄰，所以未被Tandem Repeat Finder(Gary，1999)和mreps(Kolpakov.，2003)檢測到。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹所有分支節(jié)點(diǎn)具有較高置信度(貝葉斯后驗(yàn)概率大部分為1)。系統(tǒng)發(fā)育樹包括2個(gè)大分支：一支由同盤總科的5個(gè)物種組成(包括重盤科、腹袋科Gastrothylacidae和同盤科Paramphistomidae)，另一支由片形科Fasciolidae的2個(gè)物種和棘口科Echinostomatidae的3個(gè)物種組成(圖3)。在同盤總科中，黑斑蛙重盤吸蟲與其他物種關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于貝葉斯法的11種復(fù)殖吸蟲線粒體12個(gè)蛋白編碼基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of concatenated 12 protein coding genes of mitochondrial genomes from 11 species of Digenea based on Bayesian inference

3 討論

復(fù)殖吸蟲的宿主特異性較弱，生活史中可選擇不同屬，甚至不同科的物種作為終末宿主(吳寶華，1991；唐崇惕，唐仲璋，2015)。研究者曾在黑斑蛙和澤蛙的消化道中發(fā)現(xiàn)自然感染的黑斑蛙重盤吸蟲(高利賓，2007；周慶安，2013)，本研究中的黑斑蛙重盤吸蟲于滇蛙消化道內(nèi)發(fā)現(xiàn)，滇蛙為其宿主新記錄。

基因重排和互換是線粒體基因組的一個(gè)重要特征(張東，2020)。黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組除基因和基因發(fā)生互換外，其他基因排列與大多數(shù)復(fù)殖吸蟲一致。從已報(bào)道的、(Yan.，2013)、(Yang.，2016)和(Han.，2020)4種同盤總科吸蟲的線粒體基因組結(jié)果看，和基因互換似乎是同盤總科吸蟲的一個(gè)重要遺傳學(xué)特征。Littlewood等(2006)推測線粒體基因組中tRNA基因互換可能隱含了系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)信息(Littlewood.，2006)。本研究中黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組中和基因的互換現(xiàn)象為后續(xù)開展該類吸蟲系統(tǒng)發(fā)育研究提供了明確的靶標(biāo)。

堿基偏倚最能體現(xiàn)序列進(jìn)化的特征，其可能來自自然突變或選擇壓力等其他因素(鐘東等，2002)。本研究中黑斑蛙重盤吸蟲的蛋白編碼基因AT堿基占比為59.7%，比其他同盤總科吸蟲低。因此，我們認(rèn)為重盤屬吸蟲可能是一類GC→AT突變壓力相對較小的類群。富含GC堿基密碼子的基因通常指向了高度表達(dá)的基因(Lamolle.，2019)，扁形動(dòng)物絳蟲的相關(guān)研究也證實(shí)了這一推論(Chen.，2013；Yang.，2014，2015；Huang.，2017；Maldonado.，2018)。自然選擇是基因高度表達(dá)的結(jié)果，密碼子偏倚是堿基突變偏倚和自然選擇之間平衡的結(jié)果(Sharp & Zeng，2010；Plotkin & Kudla，2011)。綜上所述，本研究推測黑斑蛙重盤吸蟲的這種密碼子偏倚可能與重盤科吸蟲的生態(tài)多樣性和生理多樣性有關(guān)。

基于線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果更可靠(Waeschenbach.，2012)。復(fù)殖吸蟲的物種多樣性較高，加之形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的差異往往比較細(xì)微，僅依靠形態(tài)學(xué)手段往往存在“主觀誤差”：重盤屬吸蟲的形態(tài)特征與同盤科吸蟲十分相似，唐崇惕和唐仲璋(2015)將其納入同盤科。線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示，黑斑蛙重盤吸蟲單獨(dú)為一支，腹袋科和同盤科的關(guān)系與黑斑蛙重盤吸蟲更近。該結(jié)果支持Jones等(2005)的分類系統(tǒng)，認(rèn)同重盤屬隸屬于重盤科。

目前僅有85種復(fù)殖吸蟲(將其中未定種假定為不同的種)完成線粒體全基因組測序。該類吸蟲記錄物種超過18 000種(Bray.，2008)，仍有極大部分復(fù)殖吸蟲線粒體基因組信息未被研究和報(bào)道。而同盤總科的復(fù)殖吸蟲是一類不容忽視的可導(dǎo)致動(dòng)物吸蟲病的寄生蟲(Horak，1971；Yan.，2013)，影響畜牧業(yè)的發(fā)展(Anuracpreeda.，2012；王根紅，張志忠，2018)。從遺傳學(xué)和基因組學(xué)的角度進(jìn)一步揭示這類復(fù)殖吸蟲對宿主的選擇及致病機(jī)制，將有力推動(dòng)吸蟲病的防控。本研究首次揭示了黑斑蛙重盤吸蟲線粒體基因組序列及其特征，為后續(xù)開展基于線粒體基因組信息的重盤科吸蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育和流行病學(xué)研究提供重要參考。

感謝云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的敬凱老師在蛙類標(biāo)本采集與鑒定中給予的幫助。