寧曉縣，申元英，郭 樂

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

炎癥是機(jī)體對(duì)損傷因素產(chǎn)生的一種以防御為主的特異性免疫反應(yīng)，能消除有害刺激，啟動(dòng)愈合過程。然而炎癥反應(yīng)失控時(shí)，會(huì)損害正常組織，引起糖尿病、關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病〔1-2〕?；罨木奘杉?xì)胞貫穿于炎癥性疾病的整個(gè)過程，會(huì)誘發(fā)“炎癥風(fēng)暴”，造成機(jī)體嚴(yán)重?fù)p傷〔3〕，因此探索巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)分子機(jī)制有助于炎癥性疾病的治療。目前體外實(shí)驗(yàn)獲取人源性巨噬細(xì)胞的主要方法是使用佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1，進(jìn)一步用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激，極化為M1型巨噬細(xì)胞，分泌大量促炎因子〔4-5〕。

巨噬細(xì)胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domainlike receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體可被LPS激活〔6〕。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）組成，其激活有3個(gè)步驟：首先，刺激信號(hào)激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，使NLRP3和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）前體等蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增強(qiáng)；其次，NLRP3寡聚化并與ASC作用，啟動(dòng)炎性體形成；最后，NLRP3炎癥小體募集并激活Caspase-1前體，使之活化為Caspase-1，剪切、加工IL-1β前體和白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）前體，使之分別轉(zhuǎn)化為具有生物活性的IL-1β和IL-18，釋放到胞外，最終促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔7-9〕。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼且高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，主要參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控〔10〕。miR-155是一種典型的多功能miRNA，參與炎癥、病毒感染、免疫等多種生理和病理過程〔11〕。研究〔12〕發(fā)現(xiàn)，miR-155可以靶向抑制THP-1巨噬細(xì)胞中NF-κB抑制蛋白E發(fā)揮促炎作用。然而，目前尚不清楚miR-155調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)是否與NLRP3炎癥通路相關(guān)。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞構(gòu)建炎癥損傷，基于NLRP3通路探討miR-155的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1（上海中科院細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)：TCHu 57）；PMA（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB5349-1）；LPS（愛必信生物科技有限公司，批號(hào)：055：B5）；RPMI1640培養(yǎng)基（江蘇康寧生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：10-040-CVRC）；胎牛血清（美國(guó)Gibco，批號(hào)：10270106）；TRIzol試劑（美國(guó)Molecular Research Center，批號(hào)：TR118）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)：R323、Q711）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)：KR211、FP411）、miRNA-155模擬物（上海生工生物工程股份有限公司）；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific，批號(hào)：11668019）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0013C）；PBS、PBST緩沖液、5×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1020、T1031、P1040）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010、P0018）；10% PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：PG112）；兔抗GAPDH抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗Caspase-1抗體、二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)：2118、13158、3866、7074）；PVDF膜（BIO-RAD，批號(hào)：1620177）；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；迷你垂直電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印槽（韋克斯科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)GE ImageQuant LAS4000）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)RPMI1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時(shí)，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 炎癥模型構(gòu)建THP-1細(xì)胞處于生長(zhǎng)旺盛期并且狀態(tài)良好時(shí)，以1×105個(gè)/mL的密度接種于48孔板中，PMA（100 ng/mL）刺激48 h，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞；LPS（100 ng/mL）刺激1.5 h，構(gòu)建炎癥損傷模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、LPS組、miR-155過表達(dá)組（以下簡(jiǎn)稱“過表達(dá)組”）和miR-155陰性對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱“陰性對(duì)照組”）。細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)鋪板，PMA誘導(dǎo)48 h。不做任何處理的為空白對(duì)照組；LPS處理1.5 h為L(zhǎng)PS組；miR-155模擬物處理36 h，再用LPS處理1.5 h為過表達(dá)組；miR-155模擬物的陰性對(duì)照處理36 h后用LPS處理1.5 h為陰性對(duì)照組。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞中miR-155及IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NLRP3的表達(dá) 細(xì)胞按以上分組鋪板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染刺激以后，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA；按說明書反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)miR-155以及IL-1β、TNF-α和NLRP3的表達(dá)。miR-155反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min；富集低豐度目標(biāo)miRNA：94℃20 s，65℃30 s，72℃34 s，5次循環(huán)；94℃變性20 s；60℃退火、延伸34 s；其中變性、退火延伸45次循環(huán)。IL-1β、TNF-α和NLRP3反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火30 s；其中變性、退火步驟40次循環(huán)。引物序列見表1。分別選擇u6和gapdh為內(nèi)參基因，獲得Ct值后，用2-△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行定量計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)引物序列

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)上清液中IL-1β和TNFα的分泌量 收集細(xì)胞上清液于EP管中，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，分別檢測(cè)上清液中IL-1β和TNF-α的分泌量，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)物質(zhì)的實(shí)際濃度。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）分析蛋白表達(dá)THP-1細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染刺激后，每孔加入RIPA裂解液，立即將6孔板水平放于冰上30 min，提取總蛋白進(jìn)行超聲裂解，并于4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定上清液中蛋白的濃度，將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液充分混勻，100℃金屬浴10 min使蛋白充分變性。蛋白樣品選取10% SDS-PAGE恒壓120 V電泳，250 mA電流下轉(zhuǎn)到PVDF膜上，封閉液（5%脫脂奶粉）封閉1 h，PBS緩沖液洗膜3次后加入相應(yīng)一抗，放于4℃冰箱孵育。次日，PBST緩沖液洗膜后加入二抗孵育1 h，再洗膜3次，經(jīng)ECL發(fā)光液顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光得到蛋白條帶，使用Image J軟件半定量分析條帶灰度值，將蛋白條帶導(dǎo)入軟件Image J轉(zhuǎn)化為灰度圖片，并消除圖片背景的影響，設(shè)置定量參數(shù)以及單位，將蛋白條帶轉(zhuǎn)換成亮帶，手動(dòng)框選各個(gè)蛋白泳道測(cè)量得到灰度值，計(jì)算目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值，即可得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量結(jié)果用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3以及miR-155的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和NLRP3在mRNA水平的表達(dá)升高，說明炎癥模型構(gòu)建成功；同時(shí)，在LPS誘導(dǎo)的炎癥中，miR-155的表達(dá)上調(diào)。見圖1。

2.2 miR-155促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-155模擬物處理細(xì)胞后，其表達(dá)顯著升高，證明轉(zhuǎn)染成功。見圖2A。此外，過表達(dá)miR-155，增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表達(dá)。見圖2B～D。

2.3 miR-155促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的蛋白表達(dá)量將收集的上清液用于ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激，細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的分泌量增加。過表達(dá)miR-155，LPS刺激的IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平的升高更顯著。見圖3。

2.4 miR-155促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)分別檢測(cè)NLRP3信號(hào)通路中NLRP3和Caspase-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LPS刺激后細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)上升；過表達(dá)miR-155，LPS刺激的NLRP3和Caspase-1蛋白的表達(dá)水平顯著增加。見圖4。

3 討論

炎癥反應(yīng)在機(jī)體疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與該過程，其中巨噬細(xì)胞作為固有免疫的首道防線，表達(dá)甘露糖受體、清道夫受體、Toll樣受體、補(bǔ)體受體、細(xì)胞因子受體以及主要組織相容性復(fù)合體等多種表面標(biāo)志物，具有識(shí)別并清除異物、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、殺傷腫瘤和病毒感染細(xì)胞、提呈抗原和免疫調(diào)節(jié)等作用，在炎癥反應(yīng)中處于核心地位。巨噬細(xì)胞被LPS刺激后，可極化為M1型巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生和分泌IL-1β和TNF-α，導(dǎo)致炎癥損傷〔13-14〕。IL-1β和TNF-α是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子，檢測(cè)IL-1β和TNF-α的含量可以得知細(xì)胞是否處于炎癥狀態(tài)，基于以上基礎(chǔ)，本研究參考Maess等〔5〕的方法，使用100 ng/mL PMA刺激THP-1細(xì)胞48 h，將其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并用LPS刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著升高，說明成功構(gòu)建炎癥損傷模型，并驗(yàn)證了LPS具有促炎和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的作用〔15〕。

據(jù)報(bào)道〔16〕，IL-1β是NLRP3炎癥小體的下游因子，NLRP3是一組廣泛存在于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他一些免疫細(xì)胞中的多蛋白復(fù)合物，作為先天免疫的主要組成部分，NLRP3在正常情況下處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激被損害時(shí)，NLRP3則被激活并呈遞信號(hào)，誘導(dǎo)IL-1β等炎癥因子釋放，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。NLRP3在多種常見的炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在骨關(guān)節(jié)炎中，羥基磷灰石晶體能夠激活I(lǐng)L-1β并通過NLRP3炎癥小體促進(jìn)其產(chǎn)生，從而介導(dǎo)炎癥和關(guān)節(jié)疾病〔17〕；在動(dòng)脈粥樣硬化伴巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)中，NLRP3炎癥小體被激活后，通過促進(jìn)IL-1β釋放，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展〔18〕。因此，NLRP3炎癥小體被認(rèn)為是治療許多與炎癥相關(guān)疾病的有望靶點(diǎn)。同樣，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到IL-1β上調(diào)之后，繼續(xù)檢測(cè)NLRP3炎癥小體mRNA水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也升高，這一結(jié)果與之前的報(bào)道一致〔6〕，并為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平〔19〕。目前研究〔20〕發(fā)現(xiàn)多種miRNA在炎癥性疾病中異常表達(dá)，并且通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路影響炎癥因子和炎癥性蛋白的表達(dá)，從而參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，其中NLRP3研究較為廣泛。例如：miR-21正向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活，促進(jìn)IL-1β分泌和Caspase-1活化，最終促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和感染性休克；在腎臟炎癥中，miR-10可以靶向抑制NLRP3炎癥小體的組裝，抑制Caspase-1切割和IL-1β成熟，使促炎因子TNF-α和白細(xì)胞介素6的釋放減少，減輕細(xì)胞的損傷和凋亡〔21〕。由此可知，miRNA可通過調(diào)節(jié)NLRP3來影響炎癥的進(jìn)展，故此，本研究旨在探索在THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，NLRP3的激活是否也受miRNA的調(diào)控。

在miRNA家族中，miR-155在多種激活的細(xì)胞中異常表達(dá)，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，據(jù)報(bào)道用LPS誘導(dǎo)人單核細(xì)胞，在miRNA基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)上調(diào)〔22-23〕，本實(shí)驗(yàn)使用LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)上調(diào)，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，F(xiàn)an等〔24〕研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎中，miR-155通過靶向和抑制PIK3R1的表達(dá)調(diào)控PI3K/Akt通路，最終促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的體外軟骨細(xì)胞凋亡和分解代謝活性；在THP-1細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155會(huì)抑制腫瘤抑制因子SHIP1的表達(dá)，進(jìn)而激活A(yù)kt信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔25〕。由此可知，在炎癥反應(yīng)中，miR-155可通過不同的機(jī)制發(fā)揮調(diào)控功能。本研究中，在LPS刺激構(gòu)建的體外炎癥模型中過表達(dá)miR-155，發(fā)現(xiàn)THP-1巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)顯著升高，NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白NLRP3和Caspase-1的表達(dá)也升高，由此可知，miR-155可以通過激活其潛在靶點(diǎn)NLRP3信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

本研究初步探討發(fā)現(xiàn)miR-155可以激活NLRP3信號(hào)通路，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，因此通過靶向抑制miR-155/NLRP3軸，可為治療炎癥性疾病提供新思路。