唐 寅 宋愛英 韓 笑 耿智馨

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，黑龍江哈爾濱 150040

晚期非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）對化療不敏感、化療效果差、5 年存活率低[1-2]，尋找新的NSCLC 治療藥物具有迫切的臨床需求。水飛薊素（silymarin，SM）是植物水飛薊中提取得到的黃酮類化合物，有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中SM 激活Slit2/ROBO1 通路抑制C-X-C 基序趨化因子受體4（C-XC motif chemokine receptor 4，CXCR4）的表達，進而抑制肝癌細胞生長[3]。Tseng 等[4]及劉倩等[5]的研究分別證實，Slit2 的低表達及CXCR4 的高表達與NSCLC 預(yù)后不良有關(guān)，但能夠調(diào)控Slit2/ROBO1 通路及CXCR4表達的SM 在NSCLC 增殖及凋亡中的調(diào)控作用及機制尚不清楚。因此，本研究將通過細胞實驗觀察SM 通過Slit2 調(diào)控NSCLC 細胞增殖及凋亡的作用機制，旨在為今后發(fā)現(xiàn)NSCLC 新的治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 NSCLC 細胞株A549（上海中科院細胞資源中心）。

1.1.2 藥品與試劑 SM（美國Sigma 公司，貨號：S0292）；陰性對照（negative control，NC）siRNA、Slit2 siRNA（上海吉瑪公司）；MTS 法細胞增殖檢測試劑盒（丹麥Promega 公司，貨號：G3582）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司，貨號：C1086）；Slit2（貨號：47600）、CXCR4（貨號：97680）的單克隆一抗（美國CST 公司）；ROBO1 的單克隆一抗（美國Abcam 公司，貨號：ab184622）。轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen 公司，貨號：11668）。

1.1.3 儀器 細胞培養(yǎng)箱（型號：Thermo371，美國Thermo 公司）；顯微鏡（型號：TE2000-U，日本Nikon 公司）；熒光定量PCR 儀（型號：ABI7500，美國ABI 公司）；電泳儀（上海天能公司，型號：EPS600）；轉(zhuǎn)膜儀及配套電源（型號EPS1000，上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及干預(yù) 為研究SM 對A549 細胞增殖及凋亡的影響，細胞隨機分為對照組及不同劑量SM 組，對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，SM 組用含有10、20、40 mg/L SM 的培養(yǎng)基處理；為研究40 mg/L SM 調(diào)控A549 細胞增殖及凋亡的作用，細胞隨機分為si-NC 組、si-NC+40 mg/L SM 組、si-Slit2+40 mg/L SM組，si-NC 組轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-NC+40 mg/L SM 組在含有40 mg/L SM 的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-Slit2+40 mg/L SM 組在含有40 mg/L SM 的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染Slit2 siRNA。轉(zhuǎn)染均按照試劑盒說明書Lipofectamine 2 000 轉(zhuǎn)染試劑進行。每組均干預(yù)48 h，設(shè)置5 個復(fù)孔。

1.2.2 MTS 法檢測細胞增殖 將A549 細胞及轉(zhuǎn)染后的A549 細胞消化后，按照每孔2×103個細胞接種在96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組干預(yù)48 h 后每孔加入MTS 試劑盒的檢測液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后在酶標儀上檢測490 nm 波長的吸光值A(chǔ)490。

1.2.3 TUNEL 法檢測細胞凋亡 將A549 細胞及轉(zhuǎn)染后的A549 細胞消化后，按照每孔2×104個細胞接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組干預(yù)48 h 后固定細胞并采用TUNEL 試劑盒進行TUNEL 染色及DAPI 染色，在顯微鏡下隨機觀察3 個高倍視野內(nèi)TUNEL 陽性染色及DAPI 陽性染色的細胞數(shù)，計算細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞數(shù)/DAPI 陽性細胞數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot 檢 測Slit2、ROBO1、CXCR4的表達 將A549 細胞及轉(zhuǎn)染后的A549 細胞消化后，按照每孔2×105個細胞接種在12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組干預(yù)48 h 后采用細胞裂解液提取蛋白，將20 μg 蛋白與緩沖液混合并在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在1∶1 000 稀釋的Slit2、ROBO1、CXCR4 一抗或1∶5 000稀釋的β-actin 一抗中4℃孵育過夜。次日，在1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗中室溫孵育1 h，最后在凝膠分析系統(tǒng)中進行成像并對蛋白條帶進行半定量分析，得到Slit2、ROBO1、CXCR4 的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析兩兩比較采用LSD-t 法。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量SM 對A549 細胞增殖及凋亡的影響

各組細胞TUNEL 染色見圖1B，凋亡細胞TUNEL 染色陽性顯綠色熒光，細胞核DAPI 染色顯藍色熒光。10、20、40 mg/L SM 組A549 細胞的A490水平低于對照組、凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；20 mg/L SM 組A549 細胞的A490 水平低于10 mg/L SM 組，凋亡率高于10 mg/L SM 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；40 mg/L SM 組A549 細胞的A490水平低于對照組10、20 mg/L SM 組，凋亡率高于10、20 mg/L SM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量SM 對A549 細胞增殖及凋亡的影響（n=5）

2.2 不同劑量SM 對A549 細胞中Slit2、ROBO1、CXCR4 表達的影響

與對照組比較，10、20、40 mg/L SM 組A549 細胞中Slit2、ROBO1 的表達水平升高，CXCR4 的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與10 mg/L SM 組比較，20 mg/L SM 組A549 細胞中CXCR4 的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），40 mg/L SM 組A549 細胞中Slit2、ROBO1 的表達水平升高，CXCR4 的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與20 mg/L SM 組比較，40 mg/L SM 組A549 細胞中Slit2、ROBO1 的表達水平升高，CXCR4 的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 不同劑量SM 對A549 細胞中Slit2、ROBO1、CXCR4 表達的影響（n=5）

2.3 敲低Slit2 對SM 調(diào)控A549 細胞增殖及凋亡的影響

與si-NC 組比較，si-NC+40 mg/L SM 組A549 細胞中Slit2 的表達水平及凋亡率升高，A490水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與si-NC+40 mg/L SM組比較，si-Slit2+40 mg/L SM 組A549 細胞中Slit2 的表達水平及凋亡率降低，A490水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 敲低Slit2 對SM 調(diào)控A549 細胞增殖及凋亡的影響（n=5）

2.4 敲低Slit2 對SM 調(diào)控A549 細胞中ROBO1、CXCR4 表達的影響

與si-NC 組比較，si-NC+40 mg/L SM 組A549 細胞中ROBO1 的表達水平增加，CXCR4 的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與si-NC+40 mg/L SM 組比較，si-Slit2+40 mg/L SM 組A549 細胞中ROBO1 的表達水平降低，CXCR4 的表達水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 敲低Slit2 對SM 調(diào)控A549 細胞中ROBO1、CXCR4 表達的影響（n=5）

3 討論

中藥具有抗腫瘤作用，不同的中藥材及其活性成分既能直接發(fā)揮抗癌作用，也能起到放化療增敏作用[6-7]，另有部分中藥能夠減輕放化療的毒副作用[8-9]。中藥材水飛薊中的活性成分SM 在臨床上用于治療肝臟疾病，能夠減輕肝損傷、延緩肝纖維化[10-11]，也有多項基礎(chǔ)研究證實SM 具有抗癌作用[3,12-16]。本研究的分析結(jié)果顯示：SM 顯著降低NSCLC 細胞增殖A490水平、增加細胞凋亡率，提示SM 能夠在NSCLC 細胞中發(fā)揮抑癌作用，同時也增加Slit1 及ROBO1 的表達、降低CXCR4 的表達。

Slit2/ROBO1 通路是已知具有抑癌作用的信號通路，NSCLC 組織中低表達的Slit2、ROBO1 及高表達的CXCR4 與NSCLC 預(yù)后不良及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[4-5,17-19]。該通路的抑癌作用與抑制下游CXCR4 的表達有關(guān)[20-22]。在NSCLC 中，已有研究通過沉默CXCR4 表達的方式證實CXCR4 對NSCLC 細胞的增殖具有促進作用、凋亡具有抑制作用[23-25]。本研究在敲低Slit2 后觀察到SM 在NSCLC 細胞中抑制細胞增殖及CXCR4 表達、促進細胞凋亡及ROBO1 表達的作用明顯減弱，提示SM 對NSCLC細胞的調(diào)控作用部分由Slit2/ROBO1 通路介導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過細胞實驗初步發(fā)現(xiàn)SM 對NSCLC 細胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進作用；SM 的抑癌作用與激活Slit2/ROBO1 通路、抑制下游CXCR4 的表達有關(guān)。