向文遠(yuǎn) 鄧迎杰 廖 軍 方 銳

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨科，新疆烏魯木齊 830000

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是老年人致殘的主要原因[1-2]。因此尋找OA 的有效治療手段是骨科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容。以往已有研究[3-4]證實(shí)髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）能通過(guò)多途徑對(duì)骨組織損傷起到修復(fù)作用[5]，但是其成骨能力較弱，而IGF1 基因是一種能誘導(dǎo)BMSCs 向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化、成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨修復(fù)與重建中發(fā)揮重要作用[6]。本研究將通過(guò)構(gòu)建IGF1 基因慢病毒載體，并將其轉(zhuǎn)染BMSCs 后對(duì)大鼠OA 模型進(jìn)行治療，以期為OA 的臨床治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠40 只，10～12 周齡，體重280～320 g，雄性，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002，使用許可證號(hào)：SYXK（新）2018-0003，飼養(yǎng)條件：恒溫20～25℃、恒濕（50±5）%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019102283）。

1.2 主要試劑及儀器

Lenti-IGF 1-EGFP 慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：H40582）；Ⅰ型膠原C 端肽（C-terminal peptide of type Ⅰcollagen，CTX-Ⅰ）試劑盒（elabscience，批號(hào)：E-EL-R1456c）；CTX-Ⅱ試劑盒（elab science，批號(hào)：E-EL-R2554c）；白介素（interleukin，IL）-1α 試劑盒（elabscience，批號(hào)：E-EL-R0011c）；IL-6 試劑盒（elabscience，批號(hào)：E-EL-R0015c）；Trizol（Aidlab，批 號(hào)：Lot：252250AX）；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）（VAZYME，批號(hào)：R101-01/02）；SYBR Green Master Mix（RNase H）（VAZYME，批號(hào)：Q111-02）；SYBR Green Master Mix（RNase H）（VAZYME，批號(hào)：ET105-01）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司，批號(hào)：AB-P-R 001）；鼠單抗糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）（Abcam，批號(hào)：ab93926）；兔單抗β-catenin（Abcam，批 號(hào)：ab32572）；兔多抗Wnt1（Abcam，批號(hào)：ab85060）。高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：LB-516）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司，型號(hào)：TM-442）；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（上海百千生物科技有限公司，型號(hào)：MSL602）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI，型號(hào)：QuantStudio 6）；水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)：JY300）；酶標(biāo)儀（Thermo，型號(hào)：mμlISKANMK3）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG 9203A）。

1.3 BMSCs 的分離

10 只Wistar 大鼠處死，取出雙側(cè)股骨，用10 ml注射器吸出干骺端紅骨髓，加入含20 μg/ml 肝素的IMDM 培養(yǎng)液中。充分重懸后置入離心管，1 500 r/min條件下離心10 min（離心半徑10 cm），將脂肪及上清液棄去。加DMEM 培養(yǎng)液混勻稀釋至10 ml，重懸后過(guò)90 目濾網(wǎng)，接種。獲得8×105/ml 密度的細(xì)胞懸液，于5%CO2與37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 BMSCs 的培養(yǎng)及鑒定

將第3 代BMSCs（1×105個(gè)/cm2）接種于蓋玻片上，待貼壁細(xì)胞密度70%時(shí)取出蓋玻片。一抗兔抗鼠CD44 單克隆抗體（1∶25）4℃濕盒孵育過(guò)夜，使用PBS進(jìn)行3 次漂洗。二抗山羊抗兔IgG（1∶50）室溫避光孵育2 h，使用PBS 進(jìn)行3 次漂洗。避光條件下加DAB顯色劑20 min，蘇木精染色10 min，水洗，95%甘油封片，倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。第三代的BMSCs（1×106個(gè)）4 份分別與FITC 標(biāo)記的CD29、CD34、CD45、CD105，37℃孵育30 min，使用PBS 進(jìn)行2 次漂洗，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs

取第3 代BMSCs 接種于6 孔板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至60%時(shí)，用感染復(fù)數(shù)為50 的Lenti-IGF 1-EGFP 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，先在白光視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，再在熒光視野下計(jì)數(shù)表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)目，轉(zhuǎn)染效率=（熒光表達(dá)細(xì)胞數(shù)目/白光視野細(xì)胞總數(shù)）×100%，取10 個(gè)視野，計(jì)算平均值。取轉(zhuǎn)染后的BMSCs接種于6 孔板，加入不同質(zhì)量濃度（0、1、2、3、4、5 mg/ml）嘌呤霉素，選擇在10～14 d 內(nèi)讓全部細(xì)胞死亡的最低濃度作為最佳篩選濃度。另取轉(zhuǎn)染后的BMSCs 接種于6 孔板，孵育24 h 后加入最佳篩選濃度的嘌呤霉素，每隔2 d 更換新的含最佳篩選濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。收集抗性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.6 OA 大鼠模型制備及分組

取30 只Wistar 大鼠，采用膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷法建立OA 模型：麻醉后，剃凈手術(shù)區(qū)域，從內(nèi)側(cè)切開膝關(guān)節(jié)腔，外翻臏骨，將前交叉韌帶進(jìn)行剪斷。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，軟骨表面粗糙變薄，部分細(xì)胞核固縮、壞死，細(xì)胞排列紊亂表示造模成功[7]。建模成功2 周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為BMSCs+IGF1 組、BMSCs 組、模型組，每組10 只。BMSCs+IGF1 組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 ml IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs（1×107個(gè)），BMSCs 組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 ml BMSCs（1×107個(gè)）；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 ml 生理鹽水。

1.7 HE 染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化

分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織，經(jīng)10%多聚甲醛固定，將固定的軟骨組織，經(jīng)脫鈣、水合、透明、石蠟包埋后切片，切片厚度5 μm，采用HE 染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固，鏡檢觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。

1.8 ELISA 檢測(cè)大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平

取三組大鼠血液2 ml，2 000 r/min 條件下離心10 min（離心半徑10 cm）獲取血清。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μl。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗體工作液100 μl，給酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去液體，洗板3 次，每次浸泡30 s，大約350 μl/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每孔加顯色劑90 μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15 min。每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔光密度。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中骨鈣素（osteocalcin，OC）、GSK-3β、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-associated transcription factor 2，Runx2）的mRNA 表達(dá)水平

取三組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織100 mg，加入1 ml Trizol 試劑，用勻漿器研磨成漿，移至無(wú)RNase 的1.5 ml EP 管中，裂解10 min。加入200 μl 氯仿，劇烈顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min（離心半徑10 cm），可見(jiàn)分成上（RNA）中（蛋白）下（DNA）三相。轉(zhuǎn)移上層水相（約400 μl）于另一新1.5 ml EP 管中，加入400 μl 異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min，離心10 min（離心半徑10 cm），管底可見(jiàn)白色的RNA 沉淀。取RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25℃5 min，50℃15 min，85℃5 min，4℃10 min；cDNA 做N 倍稀釋，反應(yīng)條件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 s，60°C 30 s，循環(huán)40 次，以GAPDH 為內(nèi)參，繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot 檢測(cè)測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中βcatenin、Wnt1、GSK-3β 的蛋白表達(dá)水平

取三組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織100 mg，置于2 ml EP 管中，每管加200 μl 單去污劑裂解液裂解（含2 μl PMSF、2 μl 磷酸酶抑制劑），置于自動(dòng)勻漿機(jī)中勻漿，勻漿完成后將EP 管置于冰上30 min 充分裂解。裂解30 min 后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml 離心管中，然后在4℃下12 000 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm），取上清為總蛋白，二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。等量總蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。TBST 漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗鼠一抗工作液(1∶100 0)，4℃孵育過(guò)夜。TBST 漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(1∶100 0)，37℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內(nèi)二氨基聯(lián)苯胺顯色、曝光。Bio-Rad 分析系統(tǒng)掃描分析，目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白吸光度值/GAPDH 吸光度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的鑒定

細(xì)胞形態(tài)觀察顯示細(xì)胞排列緊密，逐漸融合成片，且細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)后的BMSCs 均表達(dá)CD29、CD34、CD45、CD105。見(jiàn)圖1。

圖1 BMSCs 的鑒定

2.2 IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 的效果

轉(zhuǎn)染48 h 后，IGF1 基因慢病毒對(duì)BMSCs 的轉(zhuǎn)染效率為（90.36±2.18）%，并經(jīng)最佳濃度（10 mg/ml）的嘌呤霉素篩選得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。見(jiàn)圖2。

圖2 IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 的效果（200×，標(biāo)尺長(zhǎng)100 μm）

2.3 三組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)情況

模型組關(guān)節(jié)軟骨面不平整，表層變薄，部分細(xì)胞核固縮、壞死，細(xì)胞排列紊亂。BMSCs 組小鼠膝關(guān)軟骨退變程度較模型組輕微，尚未發(fā)現(xiàn)缺損跡象，關(guān)節(jié)面較平整。BMSCs+IGF1 組軟骨完整，未見(jiàn)明顯退化，關(guān)節(jié)面平整。見(jiàn)圖3。

圖3 三組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)情況

2.4 三組大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平比較

BMSCs 組血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平均明顯低于模型組（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 組明顯低于BMSCs 組（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平的比較（）

表2 三組大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平的比較（）

注 與模型組比較，aP ＜0.05；與BMSCs 組比較，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；CTX-Ⅰ：Ⅰ型膠原C 端肽；IL：白介素

2.5 三組OC、GSK-3β、ALP、Runx2mRNA 表達(dá)水平比較

BMSCs 組OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA 表達(dá)水平均明顯低于模型組（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 組明顯低于BMSCs 組（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA表達(dá)水平的比較（）

表3 三組大鼠OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA表達(dá)水平的比較（）

注 與模型組比較，aP ＜0.05；與BMSCs 組比較，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；OC：骨鈣素；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β；ALP：堿性磷酸酶；Runx2：Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2

2.6 三組β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平的比較

BMSCs 組β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 組明顯低于BMSCs 組（P ＜0.05）。見(jiàn)表4、圖5。

表4 三組大鼠β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平的比較（）

表4 三組大鼠β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平的比較（）

注 與模型組比較，aP ＜0.05；與BMSCs 組比較，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β

圖5 三組β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白的條帶圖

3 討論

近年來(lái)，BMSCs 成為骨組織工程學(xué)領(lǐng)域一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容，給OA 的治療帶來(lái)了更大的希望。BMSCs成骨能力較弱，必須進(jìn)行體外誘導(dǎo)后才能應(yīng)用于組織工程的修復(fù)[8]。有研究[9]顯示，慢病毒攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2 的重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)具有協(xié)同促進(jìn)大鼠BMSCs 成骨分化的作用。

IGF1 是一個(gè)由人類基因IGF1 編碼的蛋白質(zhì)。以往有研究[10]顯示，IGF1 促進(jìn)軟骨損傷愈合的機(jī)制為：①對(duì)軟骨細(xì)胞的分裂與增殖進(jìn)行刺激；②增加細(xì)胞外基質(zhì)的含量；③對(duì)軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定進(jìn)行維持；④對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)行抑制。IGF1 能夠有效促進(jìn)BMSCs的增殖及軟骨分化，并維持軟骨膠原纖維的穩(wěn)定性[11]。因此本研究選擇了IGF1 基因慢病毒載體，通過(guò)慢病毒感染體外培養(yǎng)的BMSCs 將外源性IGF1 基因整合至細(xì)胞，IGF1 基因慢病毒對(duì)BMSCs 的轉(zhuǎn)染效率為（90.36±2.18）%，并篩選得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。提示外源IGF1 基因已成功整合至BMSCs，并能夠穩(wěn)定表達(dá)IGF1 基因。為探討IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs對(duì)OA 關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)能力，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了OA 大鼠模型，通過(guò)向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染骨BMSCs，觀察其在關(guān)節(jié)損傷修復(fù)中的作用。結(jié)果顯示：BMSCs+IGF1 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨完整，無(wú)明顯退化，關(guān)節(jié)面平整，BMSCs 組與模型組大鼠均存在不同程度軟骨退變，關(guān)節(jié)面不平，提示IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 能有效改善OA 大鼠的病理?yè)p傷。BMSCs 組的血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平，OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA 表達(dá)水平，β-catenin、Wnt1、GSK-3β蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組，BMSCs+IGF1 組明顯低于BMSCs 組，與段志斌[12]等研究結(jié)論基本一致。CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ是骨吸收生化標(biāo)志物，膝關(guān)節(jié)OA 患者血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ呈過(guò)表達(dá)[13-14]。IL-1α、IL-6是炎癥指標(biāo)，OA 患者炎癥越嚴(yán)重，血清IL-1α、IL-6水平越高[15-17]。此外，OC、GSK-3β、ALP、Runx2、βcatenin、Wnt1 等分子系統(tǒng)或信號(hào)通路對(duì)于調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能起到至關(guān)重要的作用，OA 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著以上分子系統(tǒng)或信號(hào)通路上調(diào)[18]。由此可以說(shuō)明，BMSCs 可通過(guò)降低相關(guān)骨吸收指標(biāo)、炎癥因子水平及調(diào)控β-catenin/Wnt1/Runx2 信號(hào)通路，對(duì)OA 大鼠起到治療作用，而IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 的治療作用更顯著。

綜上所述，IGF1 基因慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 能有效改善OA 大鼠的病理?yè)p傷，能明顯促進(jìn)膝關(guān)節(jié)損傷修復(fù)，可為OA 的臨床治療奠定基礎(chǔ)。