樊曉博，高紅芳

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714000；2.渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗檢測研究中心，陜西渭南 714000）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）是一種三苯甲烷類有機物，在皮革、紡織、制陶等領(lǐng)域可作為工業(yè)染料[1-2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，曾用于預(yù)防和治療水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和寄生蟲病，在運輸和存放中也作為滅菌劑大量使用[3-4]。孔雀石綠進入水產(chǎn)動物體內(nèi)會大量聚集，通過代謝可轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠，兩種物質(zhì)通過食物鏈進入人體，存在致癌、致畸、致突變的嚴(yán)重危害[5-7]。農(nóng)業(yè)部于2002年將其列入《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，嚴(yán)格規(guī)定其為水產(chǎn)養(yǎng)殖運輸禁用藥物[8]。但由于其價格低廉，疾病防治效果好，違法使用的情況仍長期存在[9-10]。由于工業(yè)廢水、廢渣的違法排放，水體污染和土壤污染也會造成野生水產(chǎn)動物中孔雀石綠殘留超標(biāo)[11]。2019年7月，廣東東莞石龍鎮(zhèn)漁政大隊查獲孔雀石綠污染魚200 kg；2020年7月，香港食品環(huán)境衛(wèi)生署食物安全中心在皖魚樣本中檢測出微量孔雀石綠。因此，水產(chǎn)品中孔雀石綠的監(jiān)管工作仍需加強。本文圍繞孔雀石綠的污染情況及殘留檢測技術(shù)展開綜述。

1 各地區(qū)水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況

由于孔雀石綠可有效治療和預(yù)防水產(chǎn)動物相關(guān)疾病，在養(yǎng)殖和運輸過程中違禁使用孔雀石綠的情況仍層出不窮。針對淡水魚類孔雀石綠污染情況的調(diào)查研究，可以為相關(guān)部門的整治工作提供數(shù)據(jù)支持，提升水產(chǎn)品的安全指數(shù)。

綜合近幾年不同地區(qū)的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珠三角地區(qū)市售淡水魚中孔雀石綠污染情況比較嚴(yán)重，深圳市持續(xù)3年監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，魚類污染率達8.82%，特別是深圳市羅湖區(qū)，抽取173份淡水魚樣品檢測，檢出率高達41.62%[12-13]。由于珠三角地區(qū)天氣炎熱潮濕，居民魚類消費量大，魚類養(yǎng)殖密度高，更易滋生魚類水霉病菌，因此在養(yǎng)殖過程中違法使用孔雀石綠的情況對比其他地區(qū)更加嚴(yán)重，且在運輸過程中為了保持魚類的存活率也可能存在違規(guī)使用的情況。其中污染最嚴(yán)重的魚類是桂花魚，平均污染率為20%，羅湖區(qū)更高達70%以上[12]。除此之外，羅湖區(qū)黃骨魚、脆肉魚和生魚中孔雀石綠檢出率也比較高，均在40%以上[13]。不同魚類存在生理差異，檢出率高的魚類疾病易感性強。此外，氣溫低的冬春季節(jié)魚類發(fā)病率更高，因此采樣時間也會影響調(diào)查結(jié)果。長三角地區(qū)孔雀石綠殘留率較低，上海市市售的大菱鲆、烏鱧和鱖魚中孔雀石綠檢出率為1.3%，遠低于同期開展調(diào)查的武漢市（8.93%）和陜西省（7.32%）[14-16]，由于上海市多次開展“三魚兩藥”專項整治工作，違禁藥物的使用得到了很好的控制。

通過對不同地區(qū)淡水魚進行檢測發(fā)現(xiàn)，不同省市主要污染的魚類有很大的差異，這與各個地區(qū)飲食偏好相關(guān)性高，水產(chǎn)品消費量高的地區(qū)比消費量低的地區(qū)污染嚴(yán)重，例如寧夏的肉類消費主要是牛羊肉，水產(chǎn)品消費相對較低。祁萍等[17]2010—2017年對1 400份成魚樣品進行檢測，結(jié)果表明孔雀石綠的殘存率僅有0.21%。各個地區(qū)淡水魚中均能檢出孔雀石綠殘留，總體污染情況比較嚴(yán)重，但根據(jù)居民的平均食用量進行膳食暴露評估，居民淡水魚孔雀石綠暴露健康風(fēng)險較低。由于孔雀石綠存在致癌危害，相關(guān)部門還需要加強監(jiān)管，借鑒上海市整治工作成效，對市場流通量大的魚類、易感率高的魚類進行重點監(jiān)測，同時加強對養(yǎng)殖和銷售人員的宣傳教育，從源頭杜絕污染水產(chǎn)品的流通。

2 孔雀石綠的檢測技術(shù)

2.1 儀器分析法

孔雀石綠及其代謝物的檢測主要以光譜、色譜和質(zhì)譜為代表的儀器方法為主[18-19]。其中，常用的有高效液相法[20]、氣相質(zhì)譜法[21]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-24]等。儀器法均需要對樣品進行復(fù)雜的前處理，色譜分離后進行檢測，一般耗時較長，操作煩瑣。為了改善儀器法耗時較長的缺點，各種研究不斷優(yōu)化前處理方法，縮短了檢測時間[25]。樣品前處理中通常以乙腈[26]作為提取溶劑，可以利用乙腈的極性沉淀組織樣品中的蛋白質(zhì)，提取效果好。提取 液 可 以 通 過QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法除雜。陳永平等[27]利用乙二胺-N-丙基硅烷吸附凈化提取液，在液相和質(zhì)譜條件下可以同時測定水產(chǎn)品中2種孔雀石綠和3種酰胺醇類抗生素殘留。此外，也可以通過固相萃取的方法除雜，如中性氧化鋁固相萃取小柱[28]、分散固相萃取凈化管[29]和丙磺酸固相萃取柱[30]等，均可以極大地簡化前處理過程，縮短了檢測時間，降低了有機溶劑的用量。樣品經(jīng)色譜柱分離后，進入質(zhì)譜條件檢測，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量，可建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留。林侃等[28]以氘代內(nèi)標(biāo)物標(biāo)記，利用此法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的檢出限為0.02 μg/kg，靈敏度高于國標(biāo)方法。

近年來，一種新型的敞開式電離質(zhì)譜在食品成分檢測中被廣泛應(yīng)用，這種技術(shù)是一種常壓敞開式離子化技術(shù)，無需前處理或僅需簡單的預(yù)處理，可以直接實現(xiàn)固體表面待測物的離子化，在短時間內(nèi)完成待測樣品中目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測[31]。對于直接的離子源而言，樣品在電場中可以被直接電離。養(yǎng)殖水中的孔雀石綠可以通過紙噴霧質(zhì)譜技術(shù)篩查，紙噴霧電離技術(shù)將待測物加載于固相載體上，可以避免發(fā)生毛細(xì)管阻塞等問題，檢測更加快捷。曾棟等[32]將樣品制備液加載于紙基上，在高壓電場中目標(biāo)物以電噴霧的形式進入質(zhì)譜測定，可在1 min內(nèi)檢測單個樣品。直接解吸電離離子源是一種采用介質(zhì)阻擋放電的敞開式電離質(zhì)譜技術(shù)，以氦氣作為離子化氣體，實現(xiàn)分析物的表面解吸電離。蘇晶等[33]優(yōu)化質(zhì)譜條件檢測樣品中的孔雀石綠及隱性孔雀石綠，不需要色譜分離過程，可在10～15 min內(nèi)完成檢測。

2.2 表面增強拉曼光譜

拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一種高效分子振動光譜，在膠體金、銀、銅等金屬顆粒粗糙表面會發(fā)生拉曼強度極大增強的現(xiàn)象，這種效應(yīng)稱為表面增強拉曼散射[34]。利用表面增強拉曼光譜可識別分子特征結(jié)構(gòu)信息，無需復(fù)雜前處理，實現(xiàn)無損檢測[35-38]。這種檢測技術(shù)的基底部分在檢測中起到了至關(guān)重要的作用，可以提升檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此基底的研究是該技術(shù)的重點。

目前檢測中常用的是金屬膜基底，這種基底制備對儀器、試劑和人員的要求較低[39]。吳煥樂等[40]在聚二甲基硅氧烷薄片表面采用葡萄糖還原硝酸銀沉積銀納米離子制備SERS基片，對鯽魚中孔雀石綠及其代謝物進行檢測。金納米離子作為SERS基底的研究也引起廣泛關(guān)注。趙靜晨等[41]利用表面活性劑合成樹枝狀結(jié)構(gòu)的金納米離子SERS基底。XU等[42]開發(fā)了金納米棒SERS基底，均可以快速靈敏地檢測魚肉樣品中的孔雀石綠殘留。由于金屬基底的成本較高，出現(xiàn)了金屬與非金屬組成的復(fù)合基底[43]。ZHAO等[44]在石英片上合成了金納米離子與氧化石墨烯的復(fù)合基底，以結(jié)晶紫為探針，可以檢測5種魚類的孔雀石綠殘留。除此之外，表面增強拉曼光譜也可與其他技術(shù)聯(lián)用，實現(xiàn)便攜式、手提式拉曼儀的開發(fā)。關(guān)琪等[45]制備了金納米顆粒@多孔銀纖維絲雙功能基底，將固相微萃取技術(shù)與表面增強拉曼光譜聯(lián)用，在電場作用下，可以在1 min內(nèi)實現(xiàn)水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的富集和檢測。

2.3 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)可以通過模擬抗原-抗體間特異性結(jié)合模式制備三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚合體，對靶分子進行選擇性識別，其基本原理為“鎖鑰模型”，也被稱為“仿生抗體”[46-47]。分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）性能穩(wěn)定，特異性強，適用范圍廣，在食品檢測中有良好的應(yīng)用前景。表面印跡技術(shù)是最常用的分子印跡制備方法，在選定的載體材料表面形成分子印跡聚合物，常用的載體材料有磁性納米粒子、碳納米管等。章琦[48]利用多巴胺分子制備分子印跡材料，以磁性Fe3O4納米顆粒固定孔雀石綠模板分子，形成磁性分子印跡聚合物，為檢測孔雀石綠樣品提供新的前處理方法。

量子點（Quantum Dots，QDs）是一種具有熒光的半導(dǎo)體納米晶體材料，光化學(xué)穩(wěn)定性強，利用其熒光特性制備的量子點熒光探針在食品、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用非常廣泛，但量子點熒光探針對目標(biāo)物的特異性較差，將量子點熒光探針與分子印跡技術(shù)結(jié)合形成復(fù)合材料，可以兼具高靈敏度和高選擇性。RAN等[49]以MG為模板，采用不同的功能單體，以SiO2和聚苯乙烯微球（Polystyrene Microspheres，PS）為載體，CdTe QDs和碳點CDs為熒光光源，采用沉淀聚合法制備了核-殼結(jié)構(gòu)MIP@SiO2@CdTe熒光分子探針，溶膠-凝膠法制備了核-殼結(jié)構(gòu)比率熒光探針MTP@PS-QDs&CDs，反相微乳法制備雙發(fā)射比率分子印跡探針MIPs@gQDs&rQDs，3種探針均能成功用于魚肉樣品中MG的檢測。除了熒光型分子探針外，LUO等[50]合成了具有磷光性質(zhì)的光學(xué)傳感元件摻雜量子點Mn-ZnS QDS，通過反相乳液法將Mn-ZnS QDs與分子印跡聚合物結(jié)合，制備了能識別水和魚類體內(nèi)孔雀石綠的MIP-coated QDs，這種磷光分子探針可以避免樣品基質(zhì)中的背景熒光干擾，為樣品中MG的檢測提供了新思路。

2.4 分子識別技術(shù)

分子識別技術(shù)是指通過高特異性、高選擇性的結(jié)合目標(biāo)分子實現(xiàn)檢測的分析方法，食品檢測中常用的分子識別技術(shù)是基于抗原-抗體的酶聯(lián)免疫法[51-52]。酶聯(lián)免疫法可以與量子點、磁性納米顆粒聯(lián)用，使傳統(tǒng)免疫檢測方法的準(zhǔn)確度和靈敏度不斷得到提升。陳義元等[53]利用磁性納米球與包被抗原偶聯(lián)制備感應(yīng)探針，以ZnCdS量子點作為標(biāo)記物偶聯(lián)孔雀石綠抗體制備信號探針，通過檢測熒光強度建立了間接競爭熒光標(biāo)記磁分離免疫分析方法，可以測定魚類和蝦肉中MG殘留，檢測限為0.012 μg/L。生物素-親和素系統(tǒng)與ELISA結(jié)合，通過生物素標(biāo)記，親和素識別多個生物素，結(jié)合酶標(biāo)記實現(xiàn)雙信號放大，提升ELISA方法的靈敏度。楊光昕等[54]通過N-羥基琥珀酸生物素制備生物素化抗體，利用酶標(biāo)記親和素雙重識別建立生物素-鏈霉親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法，可以測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫含量。

隨著核酸操控技術(shù)的飛速發(fā)展，多種體外技術(shù)克服了單克隆抗體技術(shù)的各種缺陷，出現(xiàn)了核酸適配體這種新型分子識別元件，是一種可以穩(wěn)定結(jié)合目標(biāo)抗原的單鏈RNA或DNA分子[55-56]。核酸適配體的目標(biāo)分子范圍極廣，包括各種有機小分子、蛋白、組織和細(xì)胞等，具有高特異性、易于化學(xué)修飾、穩(wěn)定性好等特點，在傳感檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景[57]。近年來，以膠體金作為指示載體的比色核酸適配體傳感器廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中MG的檢測。趙晨等[58]利用MG-RNA適配體結(jié)合膠體金建立可視化生物傳感器檢測方法，當(dāng)樣品中存在孔雀石綠時，檢測溶液由紅色變成藍色，可實現(xiàn)定性和定量檢測。吳文偉等[59]采用雙特異性核酸適配體（Aptamer3，A3）作為傳感探針，利用納米金光學(xué)特性，比色法可同步檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留。這種方法具有操作簡單、性能穩(wěn)定、結(jié)果可視化等優(yōu)點，比色核酸適配體傳感器具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.5 電化學(xué)傳感器法

電化學(xué)傳感器是利用待測組分電信號的變化進行檢測，具有高靈敏度、高選擇性及成本低等優(yōu)點，已經(jīng)成為藥物殘留檢測的重要工具[60]。電化學(xué)法常以聚合材料及納米材料制備電極。尚晶晶等[61]采用殼聚糖和石墨烯修飾玻碳電極，制備納米修飾電極，以隱性孔雀石綠電化學(xué)性質(zhì)測定水產(chǎn)品中2種孔雀石綠殘留。電化學(xué)法可與分子印跡技術(shù)結(jié)合，陳宏等[62]用聚合鄰氨基酚在玻碳電極表面制備分子印跡膜，構(gòu)建了MG分子印跡電化學(xué)傳感器，電極可以更好地捕獲待測物，檢測特異性高。

2.6 直讀顯色檢測法

新型的直讀顯色的檢測方法可實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析，結(jié)合待測組分時會引起顏色顯著變化，通過目視即可判斷結(jié)果，具有成本低廉、操作簡單等優(yōu)點[63]。賴姝毓等[64]制備了碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合顯色材料，首次提出了基于薄層色譜圖像分析的孔雀石綠半定量快速檢測方法，為后期實現(xiàn)水產(chǎn)中MG的現(xiàn)場檢測提供了新途徑。

3 結(jié)語

對不同地區(qū)市售水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，雖然從膳食暴露水平評估風(fēng)險較低，但是水產(chǎn)品的污染情況不容樂觀，污染率偏高。相關(guān)部門要從源頭加強監(jiān)測力度，打擊違法使用孔雀石綠的行為，不斷提升對檢測技術(shù)的要求?？兹甘G及其代謝物檢測技術(shù)不斷發(fā)展優(yōu)化，儀器法中超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法得到了廣泛應(yīng)用，簡單快速的敞開式電離質(zhì)譜技術(shù)也日趨成熟，極大地簡化了儀器法的檢測流程；表面增強拉曼光譜無需前處理，可實現(xiàn)快速無損檢測；分子印跡技術(shù)特異性強，制備簡單，可與量子點、磁性粒子結(jié)合對目標(biāo)分子進行高選擇性檢測；核酸適配體技術(shù)通過化學(xué)合成，在適宜的體外條件下篩選特定靶分子，與傳統(tǒng)的抗體相比檢測范圍更廣；電化學(xué)檢測與傳感器等新方法聯(lián)用是一種快速準(zhǔn)確的檢測方法；新型的直讀顯色檢測方法的出現(xiàn)也為孔雀石綠的即時檢測提供了可能。各種新技術(shù)的出現(xiàn)及不同技術(shù)的相互融合擴大了檢測方法的優(yōu)勢。在未來的檢測中，操作簡單、便于攜帶、檢測快速及結(jié)果直觀準(zhǔn)確是今后技術(shù)的發(fā)展方向，量子點、納米技術(shù)、核酸適配體及傳感器技術(shù)等也將在未來的檢測中被廣泛應(yīng)用。