張雪穎

（蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇蘇州 215123）

非熱加工是指利用傳統(tǒng)加熱以外的機(jī)制來滅活食源性微生物的新興食品保鮮技術(shù)，這些技術(shù)包括超高壓、脈沖電場(chǎng)、電離輻射和紫外線光等，它們最大的優(yōu)勢(shì)在于可在常溫或低溫下對(duì)食品中的病原微生物和致腐性微生物進(jìn)行高效滅活，延長食品保質(zhì)期，同時(shí)不影響食物天然風(fēng)味和口感。

1 超高壓技術(shù)概述

超 高 壓 技 術(shù)（Ultra-high Pressure Processing，UHP）是一種新型的用于滅活食源性病原菌和腐敗微生物的非熱食品保存技術(shù)，該技術(shù)的基礎(chǔ)是在比熱加工溫度低得多的情況下應(yīng)用50～1 000 MPa的靜水壓，對(duì)食品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)損失最小[1]。UHP在食品中的應(yīng)用可追溯到大約一個(gè)世紀(jì)前，直到20世紀(jì)80年代中期，UHP作為一種商業(yè)食品保存技術(shù)的應(yīng)用才重新被燃起。目前，經(jīng)UHP處理的食品已應(yīng)用于大米產(chǎn)品、肉類和家禽、蔬菜、果汁和海產(chǎn)品。然而，UHP并不適用于所有類型的食品。例如，草莓等帶有內(nèi)部氣穴的食物，在加工過程中易被碾碎。另外，由于不能破壞微生物中的孢子，故而單獨(dú)UHP不能對(duì)一些貨架穩(wěn)定的低酸食品進(jìn)行滅菌。

不正確折疊方式的蛋白可以在較低的壓力（200 MPa)下進(jìn)行重新折疊[2]。利用酶對(duì)熱和高壓處理的不同穩(wěn)定性，使用高壓選擇性地滅活某些酶類以開發(fā)出新食品。病毒衣殼蛋白在高壓環(huán)境下具有不可逆性，高壓處理可被用作疫苗研制過程中滅活病毒的方法。然而，由于高壓對(duì)微生物的高效滅菌的能力，最常見的應(yīng)用仍然是食品保鮮。

2 UHP誘導(dǎo)的微生物滅活動(dòng)力學(xué)

高壓誘導(dǎo)的微生物滅活并不總是遵循一級(jí)模型。當(dāng)繪制存活種群隨時(shí)間變化的對(duì)數(shù)圖時(shí)，首先出現(xiàn)線性下降，其次是滅活率的下降，后者通常被描述為尾跡效應(yīng)。在熱處理過程中也觀察到了類似的尾跡效應(yīng)。對(duì)腸道沙門氏菌PT4和大腸桿菌O157:H7的研究表明，熱誘導(dǎo)的尾跡效應(yīng)主要是熱休克蛋白等蛋白質(zhì)的重新合成所致[3]。然而，壓力誘導(dǎo)的尾跡效應(yīng)的作用機(jī)理仍未完全清楚。對(duì)于某些沙門氏菌而言，在分離、繁殖和再次暴露于壓力下時(shí)，尾跡效應(yīng)和原培養(yǎng)物之間并沒有明顯的壓力差異。對(duì)大腸桿菌O157:H7的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與原培養(yǎng)物相比，尾跡培養(yǎng)對(duì)UHP具有更高的抵抗力，這可能是由于細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)壓力的穩(wěn)定性較高所導(dǎo)致。NOMA等同時(shí)認(rèn)為，非離子表面活性劑的加入可能會(huì)抑制尾跡現(xiàn)象[4]。

3 UHP引起的微生物損傷

已有研究報(bào)道在高壓處理后使用差分電鍍技術(shù)會(huì)損傷細(xì)胞，處理后的存活細(xì)胞在非選擇性培養(yǎng)基和添加選擇性培養(yǎng)基上均可恢復(fù)生長。受損細(xì)胞通常在選擇性培養(yǎng)基上生長緩慢或不能繁殖，兩種培養(yǎng)基之間的群體差異被用來評(píng)估壓力誘導(dǎo)的損傷。外膜滲透使受損細(xì)胞對(duì)溶菌酶或疏水化合物（如膽鹽）致敏，但減壓后受損細(xì)胞就能恢復(fù)抵抗力[5]。在對(duì)大腸桿菌K-12菌株AB1157的研究中發(fā)現(xiàn)，99%的存活群體在膽鹽的存在下不能再次在回收瓊脂上生長，但在胰蛋白酶大豆肉湯中孵育1 h后就完全恢復(fù)，受損細(xì)胞對(duì)酸性條件或鹽的敏感性可歸因于細(xì)胞質(zhì)膜的損傷所致[6]。與外膜相比，細(xì)胞質(zhì)膜的修復(fù)需對(duì)代謝的要求更高，且需要更長的時(shí)間，而受損細(xì)胞的存在將給檢測(cè)和計(jì)數(shù)帶來困擾。此外，在食品儲(chǔ)存期間，恢復(fù)食品中受損的病原體可能對(duì)人類健康造成危害。MA[7]在調(diào)查高壓處理受損的大腸桿菌O157:H7的動(dòng)態(tài)恢復(fù)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著壓力的增加，抑制作用更強(qiáng)，而致命的作用與傷害不一致，證實(shí)了UHP損傷的大腸桿菌O157:H7可以在適當(dāng)?shù)臈l件下修復(fù)。

4 UHP滅活營養(yǎng)菌

革蘭氏陽性細(xì)菌對(duì)高壓的抵抗力一般比革蘭氏陰性菌強(qiáng)，這可能是由于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜的復(fù)雜性，這種細(xì)胞外膜比革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞外膜更容易受到UHP的影響。桿狀菌往往比球菌更敏感，球菌表面積減少可能會(huì)限制細(xì)胞泄漏，這可能是造成UHP失活的部分原因[8]。有研究表明，靜止期的細(xì)胞比指數(shù)期的細(xì)胞具有更高的耐壓能力，這可能歸因于在固定相合成的特殊蛋白質(zhì)，以抵消高壓的有害影響，熱、氧化應(yīng)激、高鹽濃度等不良條件也有相似的趨勢(shì)。大腸桿菌中的RpoS蛋白的存在和單核細(xì)胞增生李斯特菌中SigB蛋白的存在部分保護(hù)了靜止期細(xì)胞免受高壓的有害影響[9]。固定相位細(xì)胞的抗性也可能是由于膜脂的變化、肽聚糖的增稠以及膜蛋白與多肽和脂蛋白之間交聯(lián)的增加所致。當(dāng)然也有許多例外，因?yàn)榧?xì)菌對(duì)高壓的抵抗力表現(xiàn)出較大的變異性，甚至來自同一物種的菌株也是如此。MALONE等[10]調(diào)查了15株大腸桿菌O157:H7對(duì)500 MPa高壓處理的抗性，發(fā)現(xiàn)處理后的對(duì)數(shù)下降范圍在0.6～3.4 CFU/mL。

5 影響UHP微生物滅活的因素

在UHP處理期間保持溫度對(duì)細(xì)菌滅活有著顯著的影響。有兩個(gè)因素導(dǎo)致產(chǎn)品的初始溫度和加壓過程中的溫度升高，當(dāng)然這取決于食品成分。當(dāng)溫度保持在20～35 ℃時(shí)，UHP對(duì)細(xì)菌滅活效果最低；但超過35 ℃時(shí)，UHP效果明顯，這種現(xiàn)象可能是脂膜在較高溫度下容易發(fā)生的相變所致。一般來說，隨著保溫溫度的升高，所有病原體的滅活作用都明顯增強(qiáng)。高溫（＞70 ℃）與壓力相結(jié)合，幾乎可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的完全滅菌。然而，不同微生物之間的高壓和低溫協(xié)同作用也是有報(bào)道的[11]。

（1）食物中的成分影響著微生物的耐壓能力。因此，在真正的食品系統(tǒng)中需要更嚴(yán)格的高壓處理才能達(dá)到與緩沖系統(tǒng)或?qū)嶒?yàn)室培養(yǎng)基相同的滅活水平。豐富的培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的保護(hù)性，可能是因?yàn)楸匦璋被岷途S生素有助于受損細(xì)胞的恢復(fù)[12]。鈣的存在對(duì)高壓處理的大腸桿菌具有保護(hù)作用，這可能是由于加壓過程中鈣離子結(jié)合成分的修復(fù)造成的。

（2）低水活度保護(hù)微生物免受高壓侵害。然而，溶質(zhì)的性質(zhì)對(duì)高壓處理后的細(xì)胞失活有著顯著的影響。同樣，懸浮在氯化鈉或氯化鈣等離子溶質(zhì)中的凝固芽孢桿菌細(xì)胞比蔗糖或甘油等非離子溶質(zhì)中的抗性更強(qiáng)。與甘油相比，單糖和二糖對(duì)UHP具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

（3）低pH值可協(xié)同高壓作用增強(qiáng)微生物滅活效率。由于水分子的離子離解作用，加壓通常會(huì)導(dǎo)致食品基質(zhì)或懸浮緩沖液的pH值降低。壓力釋放后，pH值恢復(fù)到原始值，但pH值的突然變化是否對(duì)微生物失活有影響尚不清楚。

（4）食品級(jí)添加劑的添加可以提高UHP對(duì)病原菌的抗菌效果。通過對(duì)常用食品添加劑乳酸菌細(xì)菌素nisin和叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）進(jìn)行檢測(cè)，顯示UHP可能促進(jìn)nisin穿透細(xì)胞質(zhì)膜，尤其是對(duì)革蘭陰性菌，導(dǎo)致細(xì)菌的滅活。TBHQ的協(xié)同效應(yīng)可歸因于通過細(xì)胞[Fe-S]簇氧化TBHQ而產(chǎn)生殺菌活性氧所致。

6 UHP對(duì)微生物細(xì)胞的基本作用

UHP可以引起細(xì)胞形態(tài)、膜、生化反應(yīng)和遺傳機(jī)制的一些變化。隨著細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜的分離，加壓可以使細(xì)胞空泡化，從而使細(xì)胞拉伸5～50倍。然而，細(xì)胞形態(tài)的一些變化是暫時(shí)性的，一旦壓力釋放，細(xì)胞會(huì)恢復(fù)正常形態(tài)。

細(xì)胞膜被公認(rèn)為微生物壓力損傷的主要靶點(diǎn)之一，加壓后細(xì)胞膜滲透率的增加表現(xiàn)為ATP或紫外吸收材料的泄漏、滲透反應(yīng)能力的喪失和熒光染料的吸收增加。壓力通過增加脂質(zhì)分子的堆積密度和誘導(dǎo)脂質(zhì)與膜蛋白的分離而降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，降低脂膜的熔化溫度可以恢復(fù)膜的流動(dòng)性。研究發(fā)現(xiàn)，嗜壓深海細(xì)菌對(duì)超高壓的適應(yīng)力涉及膜脂組成從飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)變。膜ATP酶活性的喪失也可能導(dǎo)致高壓失活，但細(xì)胞質(zhì)功能的部分喪失或革蘭氏陰性菌外膜的破壞并不一定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在指數(shù)期細(xì)胞中，膜完整的喪失與UHP介導(dǎo)的致死性有關(guān)，而在靜止期細(xì)胞中，細(xì)胞膜則在減壓后重新出現(xiàn)。

UHP傾向于生化反應(yīng)，導(dǎo)致體積減小，并且通常會(huì)延緩涉及體積增大的反應(yīng)。蛋白質(zhì)內(nèi)部和蛋白質(zhì)之間的靜電和疏水相互作用尤其對(duì)壓力敏感，使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)容易受到高壓破壞，而氫鍵不受UHP的影響。高于300 MPa的蛋白質(zhì)的不可逆變性是大多數(shù)營養(yǎng)細(xì)胞和蛋白包被病毒失活的部分原因。

核糖體在加壓過程中可能會(huì)變形，從而抑制mRNA的附著。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，壓力為150～250 MPa時(shí)大腸桿菌的核糖體被完全破壞。近期的研究從遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討了微生物對(duì)UHP處理的反應(yīng)。基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)的分析揭示了參與微生物耐壓性的可能基因和蛋白。通過將無啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白基因?qū)氪竽c桿菌MG1655基因組片段，篩選出熱休克啟動(dòng)子和SOS應(yīng)答基因，以便在暴露于亞致死高壓脅迫后誘導(dǎo)[13]。這些研究表明熱休克蛋白在保護(hù)或修復(fù)UHP所致的損傷方面起著重要的作用。對(duì)大腸桿菌基因組的DNA基因芯片分析表明，壓力升高可同時(shí)引起熱應(yīng)激和冷應(yīng)激反應(yīng)。最近的一項(xiàng)DNA基因芯片分析通過比較壓力處理（亞致死性）和未處理大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)錄譜，揭示了參與大腸桿菌O157:H7耐高壓的相關(guān)基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，超過100個(gè)基因?qū)喼滤佬詨毫μ幚碛蟹磻?yīng)，包括應(yīng)激反應(yīng)、硫醇-二硫氧化還原系統(tǒng)、鐵硫簇和自發(fā)突變相關(guān)基因。負(fù)責(zé)[Fe-S]團(tuán)簇生物合成的全鐵操作子在鐵饑餓的條件下被下調(diào)。某些蛋白質(zhì)中的[Fe-S]團(tuán)簇可能使細(xì)菌細(xì)胞對(duì)壓力敏感。

7 結(jié)語

隨著消費(fèi)者對(duì)加工程度最低的新鮮食品的需求增加，人們對(duì)開發(fā)替代食品保鮮技術(shù)的興趣也開始顯現(xiàn)出來。非熱加工技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是在環(huán)境或制冷溫度下對(duì)食品中的微生物具有有效的抵抗力，從而在不影響感官質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值的情況下生產(chǎn)出保質(zhì)期更長、安全性更高的食品。然而，在非熱食品保鮮技術(shù)的應(yīng)用方面也存在一些挑戰(zhàn)。它對(duì)孢子的低效率導(dǎo)致替代技術(shù)不可能完全取代熱殺菌。此外，非熱處理后的尾跡效應(yīng)和亞致死性損傷可能會(huì)給消費(fèi)者帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。深入了解微生物滅活機(jī)理，有助于提高微生物滅活效率，從而發(fā)揮UHP更大的作用。