符婉麗，桑曉涵，陳姑，劉宸成，岑南香，王佳媚

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228）

金鯧魚（Trachinotus ovatus），又名卵形鯧鯵、黃臘鯧，屬鱸形目鯵科鯧鯵屬，暖水性中上層魚類，主要分布于印度洋、太平洋、大西洋熱帶、亞熱帶和溫帶海域[1]，富含油酸、棕櫚酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亞油酸等重要不飽和脂肪酸類，占脂肪酸總量的64%[2-3]。金鯧魚魚肉中氨基酸含量豐富，遠(yuǎn)高于其他魚類，其中含有人體必需氨基酸7種，是一種營養(yǎng)價值高、口感細(xì)嫩、味道鮮美的海產(chǎn)食品原料[3]。2020年，我國金鯧魚產(chǎn)量約為16萬t～17萬t，產(chǎn)業(yè)價值巨大，其中，內(nèi)銷量約占40%，出口量約占60%，內(nèi)銷產(chǎn)品以鮮魚、冰鮮魚和冷凍魚為主，出口產(chǎn)品以整條凍魚為主[4]。近年來，國內(nèi)外市場對新鮮產(chǎn)品的需求量穩(wěn)步上升，如何有效保持金鯧魚新鮮度是研究的重點(diǎn)。

等離子體是指在高電壓的作用下，不同氣體分子被部分或者完全電離分解成離子、電子、中性粒子、自由基、基態(tài)和激發(fā)態(tài)分子以及紫外光子等物質(zhì)的集合，被認(rèn)為是第四態(tài)物質(zhì)[5]。低溫等離子體的生成過程非常復(fù)雜，主要形成帶電粒子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等活性成分[6]。近幾年，低溫等離子體在食品應(yīng)用方面已有相關(guān)研究。低溫等離子體可以有效減緩冰鮮魷魚的酶解程度，降低有機(jī)大分子結(jié)構(gòu)改變的速率，增強(qiáng)冰鮮魷魚的保水性[7]，能殺死生鮮草魚表面的微生物和避免魚肉中的組胺含量超標(biāo)，延長魚肉貨架期并保證魚肉品質(zhì)[8]。等離子體活化冰能有效抑制貯藏期東方對蝦微生物的生長速度，對γ－變形菌綱弧菌目生長抑制效果較為明顯[9]。等離子體活化水冰能有效抑制三文魚片表面單增李斯特菌的生長繁殖，顯著減緩三文魚片pH值和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值的升高，提高三文魚片新鮮程度[10]。但是，Vandamme等[11]研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體產(chǎn)生的氧化物可以促進(jìn)油酸氧化，會增加油脂含量高的食品脂質(zhì)氧化的風(fēng)險。

本文采用不同條件低溫等離子體對金鯧魚進(jìn)行處理，研究低溫等離子體對金鯧魚中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化的影響，為低溫等離子體在金鯧魚保鮮包裝方面提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮金鯧魚（個體質(zhì)量約1 500 g～2 000 g）：市售。

總蛋白定量測試盒：南京建成生物工程研究所；溴酚藍(lán)溶液、磷酸鹽緩沖溶液、三氯乙酸、硫代巴比妥酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸溶液、十二烷基硫酸鈉、鹽酸胍、2，4－二硝基苯肼、2－二硝基苯甲酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、尿素、無水乙醇、乙酸乙酯：西隴科學(xué)股份公司；氯化鈉：廣東廣試試劑科技有限公司。所有試劑均為優(yōu)級純。

1.2 儀器與設(shè)備

BK130/36高壓電轉(zhuǎn)換器：美國PHENIX公司；PL303電子分析天平：梅特勒－托利多儀器有限公司；722G紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限公司；制冰機(jī)：中外合資廣州柯尼塔電器有限公司；IW-86L338超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；TGL-16MS型臺式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；H-360氣調(diào)包裝機(jī)：蘇州森瑞保鮮技術(shù)有限公司；XC07-II型無菌拍打式均質(zhì)器：南京寧凱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮金鯧魚和冰塊一起包裝運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，洗凈，去頭、去皮、去尾。依照背鰭的位置，將魚分成兩部分，去骨，用蒸餾水將魚肉表面的污漬清理干凈，并用廚房紙吸附魚肉表面的水分。將魚肉均勻分切，再稱取適量魚肉放入塑料包裝盒中，密封，進(jìn)行低溫等離子體處理。

1.3.2 樣品處理?xiàng)l件

1.3.2.1 處理時間

樣品采用空氣包裝，以直接處理方式，在70kV分別處理 0、1、2、3、4、5min，處理后立即打開包裝，取樣測定。

1.3.2.2 處理電壓

樣品采用空氣包裝，以直接處理方式，分別在40、50、60、70、80 kV 處理 3 min，處理后立即打開包裝，取樣測定。

1.3.2.3 處理次數(shù)

樣品采用空氣包裝，以直接處理方式，在70 kV處理 3 min，處理時間 3 min 平均分成 1、2、3、4 次，每次間隔30 s。處理后立即打開包裝，取樣測定。

1.3.2.4 處理后放置時間

樣品采用空氣包裝，以直接處理的方式，在70 kV處理3 min，分別在處理后立即打開包裝和4℃放置24 h打開包裝，取樣測定。

1.3.2.5 處理方式

樣品采用空氣包裝，分別以直接和間接處理方式，在70 kV處理3 min，處理后立即打開包裝和在4℃放置24 h，取樣測定。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 肌原纖維蛋白提取

取5 g（精確到0.01 g）魚肉樣品于25 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L）中。用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，10 000 r/min均質(zhì)5次，每次10 s。完成后放入離心機(jī)，10 000 r/min離心10 min。倒掉上清液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀3次，后加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.6 mol/L氯化鈉，磷酸鹽緩沖溶液），同樣條件下均質(zhì)1次，完成后放入冰箱提取18 h。18 h后將樣品放入離心機(jī)，10 000 r/min離心10 min。取上清液作為肌原纖維蛋白溶液測定。

1.3.3.2 羰基含量測定

參照陳曉楠等[12]的方法，并稍作修改。將肌原纖維蛋白原液稀釋至2 mg/mL，在2 mL離心管內(nèi)加入0.5 mL肌原纖維蛋白稀釋液和0.5 mL 2，4－二硝基苯肼（10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼，2 mol/L 鹽酸），對照組也加入0.5 mL肌原纖維蛋白稀釋液和0.5 mL 2 mol/L鹽酸溶液（不含2，4－二硝基苯肼），室溫下反應(yīng)1 h。再加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液，在12 000 r/min條件下離心10 min（4℃），倒掉上清液，加入1 mL無水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液，同樣條件下重復(fù)離心操作4次，至沉淀無顏色。將沉淀物溶于1.5 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37℃下準(zhǔn)確水浴15 min，在12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，鹽酸胍溶液進(jìn)行調(diào)零。在370 nm處測吸光值后進(jìn)行羰基含量計算。

式中：A為370 nm波長處的吸光值；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)22 000，L/（mol·cm）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3.3 總巰基含量測定

按照徐紅艷等[13]的方法進(jìn)行測定。將肌原纖維蛋白原液稀釋至2 mg/mL，取0.5 mL肌原纖維蛋白稀釋液，加入2 mL尿素－十二烷基硫酸鈉溶液（8.0 mol/L尿素，30.0 g/L十二烷基硫酸鈉，0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH值為7.4）和0.5 mL 10 mmol/L 2－二硝基苯甲酸試劑（0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH值為7.4）。用磷酸鹽緩沖溶液代替肌原纖維蛋白稀釋液做對照組。室溫下反應(yīng)15 min，取上清液在412 nm下測定吸光值。

式中：A為412 nm波長處的吸光值；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)11 400，L/（mol·cm）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3.4 表面疏水性測定

根據(jù)張晗等[14]的方法進(jìn)行測定。用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mmol/L）將肌原纖維蛋白原液稀釋至2 mg/mL。取1 mL肌原纖維蛋白稀釋液，加入1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液200 μL。用磷酸鹽緩沖溶液代替肌原纖維蛋白稀釋液做對照組?；旌暇鶆?，25℃下反應(yīng)10 min，后3 000 r/min離心15 min，將上清液稀釋10倍，在595 nm波長處測吸光值。以磷酸鹽緩沖液作為空白，溴酚藍(lán)結(jié)合量按下式計算。

式中：A1為空白對照組溴酚藍(lán)吸光值；A2為樣品吸光值。

1.3.3.5 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值測定

依據(jù)GB 5009.181—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛》[15]中的方法進(jìn)行測定，并稍作改良。取魚肉樣品2 g（精確到0.01 g），加入10 mL三氯乙酸混合液，均質(zhì)，加蓋密封后置于恒溫振蕩器內(nèi)50℃振搖30 min。取出，冷卻至室溫，雙層濾紙過濾。棄去初濾液，續(xù)濾液備用。移取濾液5 mL于試管內(nèi)，加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，另取5 mL三氯乙酸混合液加5 mL硫代巴比妥酸水溶液作為樣品空白，加塞混勻。沸水浴中反應(yīng)30 min，冷卻。以樣品空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于532 nm處測定樣品溶液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，Origin 2020軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白羰基含量的影響

低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白羰基含量的影響如圖1所示。

金鯧魚蛋白質(zhì)羰基含量隨低溫等離子體處理時間的延長而整體上顯著上升（P<0.05），處理5 min時羰基含量為4.28 nmol/mg。處理電壓越高，金鯧魚蛋白質(zhì)羰基含量也越高，當(dāng)電壓增高到80 kV時，羰基含量為1.60 nmol/mg。低溫等離子體處理過程中產(chǎn)生大量具有氧化作用的活性粒子，氧化氨基酸殘基側(cè)鏈，尤其是側(cè)鏈上有NH—或NH2基團(tuán)的氨基酸，生成羰基化合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化變性。升高處理電壓，不僅能破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，增加肌原纖維蛋白中游離氨基酸含量[16]，還能有效提高低溫等離子體放電功率，增加高能粒子密度[17]，使自由基和活性成分含量增加，從而提高蛋白質(zhì)氧化效率?？偺幚頃r間（180 s）固定不變，隨著處理次數(shù)增加，魚肉羰基含量顯著下降（P<0.05）。低溫等離子體處理次數(shù)增加即處理時間縮短，短時處理產(chǎn)生的活性成分如活性氮和活性氧很難被激發(fā)或產(chǎn)生的量很少[18]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度減弱。處理后放置24 h的魚肉羰基含量略高于處理后放置0 h。因低溫等離子體中大部分活性物質(zhì)壽命很短，且穿透度淺[19]，長時間貯藏影響效果不明顯。直接處理的樣品羰基含量顯著高于間接處理組（P<0.05）。直接處理中樣品直接暴露于低溫等離子區(qū)域中，處理產(chǎn)生的活性成分可直接與相關(guān)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度加劇。

2.2 不同低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白總巰基含量的影響

低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白總巰基含量的影響如圖2所示。

總巰基含量與蛋白質(zhì)氧化程度呈負(fù)相關(guān)，是評定蛋白質(zhì)氧化程度的一個重要指標(biāo)。肌原纖維蛋白中含有大量巰基，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生氧化時，內(nèi)部巰基就會形成二硫鍵[20]?？値€基含量隨低溫等離子體處理時間延長而顯著下降（P＜0.05）。低溫等離子體激發(fā)過程中會產(chǎn)生ROS等活性物質(zhì)，且ROS攻擊的重要位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基[21]，促使二硫鍵生成，導(dǎo)致總巰基含量降低。隨處理時間延長產(chǎn)生的活性物質(zhì)增多，導(dǎo)致半胱氨酸的巰基基團(tuán)損失加劇，氧化程度升高。金鯧魚蛋白質(zhì)總巰基含量隨處理電壓升高呈下降趨勢，當(dāng)電壓低于60 kV總巰基含量顯著性下降（P＜0.05），高于60 kV時變化不顯著。當(dāng)處理電壓高于60kV時，氣體之間的相互碰撞就會加劇，使得電離狀態(tài)不穩(wěn)定，各類粒子進(jìn)一步聚合或是部分反應(yīng)消耗[22]，對魚肉蛋白質(zhì)的攻擊作用減弱。魚肉蛋白質(zhì)總巰基含量隨處理次數(shù)增多而緩慢上升，總處理時間（180 s）不變，處理次數(shù)增加，易導(dǎo)致活性氧含量偏低。海春旭等[23]發(fā)現(xiàn)，低劑量活性氧不能徹底破壞細(xì)胞的生理平衡，甚至能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)反應(yīng)進(jìn)行，起到一定的抗氧化作用。處理后放置0 h的總巰基含量高于處理后放置24h（P＜0.05），肌原纖維蛋白發(fā)生氧化，其內(nèi)部巰基就會被暴露形成二硫鍵，且氧化過程不可逆。因處理后放置時間增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化時間延長，氧化程度加深。間接處理的總巰基含量略高于直接處理，說明直接處理能促進(jìn)金鯧魚蛋白質(zhì)氧化。

2.3 不同低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白表面疏水性的影響

低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚蛋白表面疏水性的影響如圖3所示。

蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化時，埋藏于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基會暴露于分子表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加，即表面疏水性與蛋白質(zhì)氧化程度成正比。因溴酚藍(lán)具有結(jié)合疏水性基團(tuán)的能力，通常用溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性。溴酚藍(lán)結(jié)合量隨處理時間延長呈上升趨勢，處理時間2 min～4 min，活性成分含量快速積累，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變松散，溴酚藍(lán)結(jié)合量快速增加。處理電壓增加，溴酚藍(lán)結(jié)合量整體上顯著上升（P＜0.05）。當(dāng)總處理時間（180 s）恒定，溴酚藍(lán)結(jié)合量隨低溫等離子體處理次數(shù)增加呈下降趨勢；處理次數(shù)超過2次時，魚肉中的肌原纖維蛋白和脂質(zhì)氧化程度減弱?？偺幚頃r間不變，處理次數(shù)增多，導(dǎo)致活性成分和自由基與魚肉蛋白質(zhì)和脂質(zhì)反應(yīng)時間縮短，盡管激發(fā)次數(shù)增多，表面疏水性也未表現(xiàn)差異性。延長處理后放置時間和改變處理方式都能顯著影響魚肉的表面疏水性。Luo等[16]指出肌原纖維蛋白結(jié)合水能力的強(qiáng)弱與α－螺旋結(jié)構(gòu)含量有關(guān)，低溫等離子體處理促使α－螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，減弱肌原纖維蛋白結(jié)合水能力。

2.4 不同低溫等離子體處理?xiàng)l件對金鯧魚TBARS值的影響

低溫等離子體處理時間對金鯧魚TBARS值含量的影響如圖4所示。

硫代巴比妥酸值（TBARS值）表示脂質(zhì)氧化生成丙二醛的含量[24]，用于評價脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物進(jìn)一步氧化成二級產(chǎn)物的程度。處理時間越長，金鯧魚肉的TBARS值越高；增加處理電壓，TBARS值也隨之增加。R?d等[25]發(fā)現(xiàn)，低溫等離子體處理電壓、處理時間增加，豬肉中脂質(zhì)氧化程度也會增加。隨處理時間延長，處理電壓升高，等離子體形成的氧化活性粒子增多，魚肉中的不飽和脂肪酸被氧化分解，導(dǎo)致TBARS值升高。當(dāng)處理總時間固定3 min，處理次數(shù)由1變?yōu)?時，金鯧魚肉的TBARS值顯著下降（P<0.05），當(dāng)處理次數(shù)繼續(xù)增加至4，魚肉的TBARS值緩慢下降。處理次數(shù)越多，低溫等離子體對魚肉脂質(zhì)氧化作用越小。處理后放置24 h，樣品的TBARS值升高不顯著。放置時間對魚肉中脂質(zhì)氧化影響不顯著，這與前面對蛋白質(zhì)的影響效果相一致。直接處理組金鯧魚肉的TBARS值略高于間接處理組。盡管間接處理時，魚肉樣品和電極之間存在較遠(yuǎn)距離，但是對魚肉脂質(zhì)氧化的影響不明顯。因此，影響低溫等離子體處理后金鯧魚的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的主要因素為處理電壓、處理時間和處理次數(shù)，而處理后放置時間和間接處理方式對魚肉氧化的影響作用不顯著。

3 結(jié)論

升高處理電壓和延長處理時間，都能增強(qiáng)金鯧魚肉的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化；當(dāng)總處理時間（180 s）不變，增加處理次數(shù)，能夠降低脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化程度；延長處理后放置時間和間接處理方式，魚肉中氧化指標(biāo)未發(fā)生顯著變化。低溫等離子體處理能夠加快金鯧魚中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化反應(yīng)，不同處理?xiàng)l件因素對其氧化程度影響較高，因此，采用低溫等離子體處理時，應(yīng)嚴(yán)格控制處理?xiàng)l件，將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度控制在可接受范圍內(nèi)，保證魚肉品質(zhì)為消費(fèi)者所接受。