潘月影，許娜娜，蘇夢(mèng)香，季慧*

（1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.青島市糧油質(zhì)量檢測(cè)和軍隊(duì)供應(yīng)中心，山東 青島 266071）

豌豆又叫寒豆、雪豆，在我國(guó)中部及東北部地區(qū)有大量種植，其產(chǎn)量在豆類(lèi)農(nóng)作物中排名第四，食用性?xún)H次于大豆。除了食用，國(guó)內(nèi)對(duì)豌豆的深加工主要是從中提取淀粉，用于制作粉絲，加工過(guò)程中的副產(chǎn)物豌豆蛋白在豌豆中含量很高，約占豌豆干重的23.3%～31.7%[1]，其作為一種植物源蛋白具有低脂、低熱量、低致敏性和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]等特點(diǎn)。豌豆蛋白氨基酸組成比較平衡，是賴(lài)氨酸等必需氨基酸的良好來(lái)源，生物價(jià)為48%～64%，功效比為0.6～1.2，高于大豆蛋白[3]。豌豆蛋白因其突出的特點(diǎn)，近年來(lái)成為食品行業(yè)的焦點(diǎn)。然而豌豆蛋白的功能性質(zhì)較差，加熱過(guò)程中易變性，溶解性降低[4]，限制了其在食品行業(yè)的應(yīng)用，因此尋求一種安全可靠的方法來(lái)提高豌豆蛋白的溶解性，是增加其蛋白資源附加值和擴(kuò)大豌豆產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵。

為了提高蛋白的溶解性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了一系列的蛋白改性方法，最常見(jiàn)的是物理方法、化學(xué)方法和酶法，包括超聲處理[5]、動(dòng)態(tài)高壓微流化[6]、微粉化[7]、熱處理[8]、酶解[9]等。物理改性方法是價(jià)格低廉型、環(huán)境友好型、安全無(wú)毒型的蛋白質(zhì)處理方法，在蛋白質(zhì)加工中被廣泛應(yīng)用。化學(xué)改性可能會(huì)產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物；酶法改性作用條件溫和，專(zhuān)一性強(qiáng)，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)原有的功能性質(zhì)，實(shí)用性強(qiáng)。

目前，對(duì)豌豆蛋白的研究主要集中于不同的熱處理[10]、高壓[11]、超聲和pH值[12]等對(duì)其功能性質(zhì)的影響，然而運(yùn)用高速剪切和熱處理相結(jié)合的方法來(lái)改善豌豆蛋白功能性質(zhì)的研究較少。高速剪切和熱處理屬于物理改性的范疇，具有安全、無(wú)毒性、環(huán)保等特點(diǎn)，是一種綠色改性技術(shù)；并且與傳統(tǒng)的磁力攪拌處理相比，高速剪切的物理力更強(qiáng)，有利于蛋白溶解。本研究采用高速剪切和熱處理相結(jié)合的方法處理豌豆蛋白溶液，通過(guò)研究該處理方法對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響，探究最佳處理?xiàng)l件，以期改善豌豆蛋白的功能特性，進(jìn)而提高使用價(jià)值，拓寬應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白粉（≥99%）：山東塔林食品有限公司；血清白蛋白（≥98%）：合肥千盛生物科技有限公司；磷酸（≥85%）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、石蠟油、十二烷基硫酸鈉、無(wú)水乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯高速剪切分散乳化機(jī)（AD300S-H）：上海昂尼儀器儀表有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（L6S）：上海儀電分析儀器有限公司；高速離心機(jī)（TG16G）：河南北弘實(shí)業(yè)有限公司；磁力攪拌加熱鍋（SY-DF3-2A）：上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別配制1%和14%的豌豆蛋白懸浮液于錐形瓶中，放入冰箱中過(guò)夜，充分水合備用。之后進(jìn)行高速剪切和熱處理，取部分處理后的樣品真空冷凍干燥后測(cè)定性質(zhì)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 高速剪切轉(zhuǎn)速對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響

水合過(guò)夜后，取出豌豆蛋白溶液，用磁力攪拌加熱鍋攪拌至溫度為25℃，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)速為0、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 r/min，時(shí)間為 2.5 min 的高速剪切處理，剪切結(jié)束后，測(cè)定溶解性。

1.3.2.2 高速剪切時(shí)間對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響

方法同1.3.2.1，控制高速剪切過(guò)程中溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為 7 000 r/min，時(shí)間分別為 0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min，測(cè)定溶解性。

1.3.2.3 熱處理溫度對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響

方法同1.3.2.1，控制高速剪切轉(zhuǎn)速為7 000 r/min，時(shí)間為 2 min，熱處理溫度分別為 25、60、70、80、90、100℃，測(cè)定溶解性。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定高速剪切轉(zhuǎn)速、時(shí)間、溫度各因素的最佳范圍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1（D為空白列，在方差分析中作為誤差列），每份樣品平行制備3份，計(jì)算平均溶解性，確定高速剪切協(xié)同熱處理最佳工藝并探究其對(duì)豌豆蛋白功能性質(zhì)的影響。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.4 豌豆蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定方法

1.3.4.1 溶解性的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[13]測(cè)定豌豆蛋白的溶解性，以每升水溶液中溶解豌豆蛋白的毫克數(shù)來(lái)表示豌豆蛋白的溶解性。

1.3.4.2 持水性的測(cè)定

分別取各豌豆蛋白凍干粉1 g（W1）加入到已知質(zhì)量的離心管（W2）中，再加入20 mL去離子水，攪動(dòng)溶液，振蕩離心管，使其充分溶解，之后在30℃的恒溫水浴鍋中放置30 min，再在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，傾去上清液，稱(chēng)量總質(zhì)量（W3）。計(jì)算豌豆蛋白的持水性。

1.3.4.3 持油性的測(cè)定

分別取各豌豆蛋白凍干粉1g（W1）加入到已知質(zhì)量的離心管（W2）中，再加入20mL石蠟油，攪動(dòng)溶液，振蕩離心管，使其充分溶解，之后在30℃恒溫水浴鍋中放置30min，最后在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，傾去多余的油液，稱(chēng)量總質(zhì)量（W3）。計(jì)算豌豆蛋白的持油性。

1.3.4.4 乳化性的測(cè)定

根據(jù)Guo等[14]的方法稍作調(diào)整，經(jīng)熱處理后的豌豆蛋白溶液，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液15 mL，加入5 mL石蠟油，用高速剪切機(jī)處理混合溶液1 min，設(shè)定高速剪切的轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，制得乳液，在液體均勻時(shí)，立刻從底部吸取0.05 mL的乳液，加到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中混合攪拌均勻，在波長(zhǎng)為500 nm處測(cè)定該液體的吸光度，記為A0。之后按照下式計(jì)算豌豆蛋白的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI），用來(lái)描述蛋白的乳化性能。

式中：N為稀釋倍數(shù)；θ為油體積分?jǐn)?shù)，%；C為溶液濃度，g/mL；A0為起始吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件（Version 25.0）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 高速剪切轉(zhuǎn)速對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響結(jié)果

高速剪切轉(zhuǎn)速對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響見(jiàn)圖1。

如圖1所示，固定處理溫度25℃，高速剪切時(shí)間2.5 min，隨著高速剪切轉(zhuǎn)速的逐漸增大，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當(dāng)轉(zhuǎn)速為6 000 r/min時(shí)，溶解性最大，為76.59 mg/L，與未處理相比增加了22.11%。可能是因?yàn)榧羟辛ζ茐牧说鞍组g的氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用，使蛋白質(zhì)聚集體的尺寸減小，表面積增加，從而使蛋白與水的作用面積增大，溶解性增加[15]。并且剪切轉(zhuǎn)速越大，對(duì)蛋白的破壞程度越大，蛋白尺寸越小，故在一定的范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的增大，溶解性增加。但當(dāng)轉(zhuǎn)速增大到一定程度時(shí)，溶解性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦邚?qiáng)度的機(jī)械能轉(zhuǎn)化成了熱能，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，變性后聚集[16]。因此，在正交試驗(yàn)中，剪切轉(zhuǎn)速選用5 000、6 000 r/min和7 000 r/min。

2.1.2 高速剪切時(shí)間對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響結(jié)果

高速剪切時(shí)間對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響見(jiàn)圖2。

由圖2所示，固定高速剪切轉(zhuǎn)速7 000 r/min，處理溫度25℃，隨著剪切時(shí)間的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當(dāng)剪切時(shí)間為2.0 min時(shí)，溶解性最大，為80.63 mg/L，與未處理相比增加了28.56%。溶解性增加可能是因?yàn)榧羟辛κ沟鞍踪|(zhì)的表面結(jié)構(gòu)打開(kāi)[17]，蛋白比表面積增大，活性位點(diǎn)增加[18]，蛋白與水相互作用的概率增加。隨后，溶解性呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的剪切作用使機(jī)械能轉(zhuǎn)化成了熱能，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，變性后聚集[19]。因此，在正交試驗(yàn)中，剪切時(shí)間選用1.5、2.0 min和2.5 min。

2.1.3 熱處理溫度對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響結(jié)果

熱處理溫度對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，固定高速剪切轉(zhuǎn)速7 000 r/min，時(shí)間2.0 min，隨著熱處理溫度的增加，豌豆蛋白的溶解性先增加后減小，當(dāng)熱處理溫度為80℃時(shí)，溶解性最大，為88.98 mg/L，與未經(jīng)熱處理（25℃）相比增加了10.36%。當(dāng)熱處理溫度低于80℃時(shí)，隨著溫度的升高，溶解性增加，可能是因?yàn)榫S持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力疏水相互作用是吸熱反應(yīng)，升高溫度會(huì)增強(qiáng)疏水相互作用，從而使疏水基團(tuán)之間能更好地締合，藏于溶質(zhì)分子內(nèi)部，極性基團(tuán)暴露于溶質(zhì)表面[20]；也可能是因?yàn)閹€基轉(zhuǎn)化成二硫鍵[21]，二硫鍵的生成迫使肽鏈不同地方的氨基酸殘基聚集在一起，迅速折疊形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其中疏水性氨基酸殘基會(huì)分布在二硫鍵附近[22]，從而更多的疏水基團(tuán)被鎖定在分子內(nèi)部。

但隨著處理溫度再升高，豌豆蛋白獲得更高的能量，使其能夠破壞維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力、靜電力和疏水相互作用等，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使蛋白質(zhì)變性。一般在55℃蛋白質(zhì)開(kāi)始變性[23]，但蛋白質(zhì)的變性不一定導(dǎo)致溶解性下降[24]。當(dāng)處理溫度高于80℃時(shí)，蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，從而使包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，故溶解性下降[15]。此外，溶解性下降還可能是因?yàn)?，溫度升高?huì)加劇蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)，促使蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生相互碰撞的概率增大，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[10]。因此，在正交試驗(yàn)中，熱處理溫度選用70、80℃和90℃。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表2極差分析結(jié)果可知，影響豌豆蛋白溶解性大小的因素順序?yàn)锳（剪切轉(zhuǎn)速）＞B（剪切時(shí)間）＞C（熱處理溫度）。由表3可知，因素A（剪切轉(zhuǎn)速）和B（剪切時(shí)間）對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響具有顯著性（P＜0.05），是影響豌豆蛋白溶解性的主要因素，因素C（熱處理溫度）對(duì)豌豆蛋白溶解性的影響較小。由以上結(jié)果分析得出最佳剪切工藝條件為A3B2C2，即剪切轉(zhuǎn)速7 000 r/min，剪切時(shí)間2.0 min，熱處理溫度80℃。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

高速剪切協(xié)同熱處理對(duì)豌豆蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，剪切轉(zhuǎn)速為7 000 r/min，剪切時(shí)間為2.0 min，熱處理溫度為80℃時(shí)，豌豆蛋白的溶解性為88.98 mg/L，其比正交試驗(yàn)中的任何一次實(shí)驗(yàn)的溶解性都大，表明該處理?xiàng)l件可作為豌豆蛋白的最佳改性條件。并且與未處理的豌豆蛋白相比，經(jīng)過(guò)該處理后的蛋白溶解性、持水性、持油性和乳化性分別增加了41.87%、56.82%、12.50%和13.17%。豌豆蛋白持水性增加可能是因?yàn)闇囟壬撸肿拥牟祭蔬\(yùn)動(dòng)增加，水分子在蛋白中分布更均勻，蛋白更易吸水。持油性和乳化性增加可能是因?yàn)楦咚偌羟惺沟鞍捉Y(jié)構(gòu)展開(kāi)，原來(lái)藏在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，蛋白更易包裹油滴。

3 結(jié)論

高速剪切和不同熱處理對(duì)豌豆蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性均有一定的影響，綜合分析得出最佳處理?xiàng)l件：高速剪切轉(zhuǎn)速7 000 r/min，時(shí)間2.0 min，熱處理溫度80℃，此條件下，豌豆蛋白的溶解性達(dá)到最大，持水性、持油性和乳化性也有一定程度的增加。綜上，通過(guò)對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行高速剪切和熱處理，其功能性質(zhì)得到改善，這為豌豆蛋白在食品中的應(yīng)用提供了參考，可以推動(dòng)豌豆蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用，提高蛋白資源的利用率。