胡秋霞,康 樂,何建昇,趙智勇,郭俊俊
(山西省科技資源與大型儀器開放共享中心,山西太原 030012)
藜麥屬于藜科藜屬植物,是典型的假谷物代表,因其營養(yǎng)豐富、全面,被認(rèn)為是唯一一種能滿足人體全部營養(yǎng)需求的谷物,亦被稱為最具有發(fā)展前景的“黃金健康食品”之一[1-3]。研究表明,藜麥中含有氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪類、淀粉、維生素、礦物元素及多酚類、黃酮類和皂苷類等活性成分,具有很高的食用、保健、醫(yī)療、觀賞等價(jià)值,越來越受到人們的關(guān)注[4-8]。
藜麥的種植歷史悠久,源于南美,因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和種植的抗旱性、耐鹽堿性、耐寒性、耐貧瘠性且適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn),在許多國家得以推廣種植[9-10]。目前我國亦有十余省份正在推廣種植,尤其是山西省,作為雜糧王國,藜麥?zhǔn)请s糧之“特”,山西省靜樂縣更是被譽(yù)為“藜麥之鄉(xiāng)”[11]。山西的藜麥缺乏科學(xué)客觀的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo),品牌優(yōu)勢尚未形成,一些精深產(chǎn)品加工企業(yè)和高端產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)都有采購?fù)馐≡系囊庀?,這對山西省藜麥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了消極影響。建立山西藜麥的科學(xué)客觀評價(jià)體系和產(chǎn)品評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),對山西藜麥的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的推動(dòng)作用,因此,評價(jià)山西藜麥質(zhì)量情況成為了一項(xiàng)重要工作。
為了辨別山西藜麥與其他地區(qū)藜麥?zhǔn)欠翊嬖诓町?,發(fā)現(xiàn)更多山西藜麥質(zhì)量評價(jià)指標(biāo),從而更全面地評價(jià)山西藜麥質(zhì)量,本研究收集了山西省不同地區(qū)不同品種藜麥試樣30余種,采用高效液相色譜(HPLC)建立了山西藜麥指紋圖譜;利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)對其進(jìn)行相似度評價(jià);基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué),運(yùn)用SPSS 22.0軟件對其進(jìn)行主成分分析(PCA)和系統(tǒng)聚類分析研究(HCA),利用SIMCA 14.1軟件對其進(jìn)行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),從而為山西藜麥質(zhì)量評價(jià)提供全面的指導(dǎo)和理論參考依據(jù)。
1.1.1 試驗(yàn)材料 藜麥:從各種流通渠道購買,并與廠家核實(shí)后采購,均產(chǎn)自2020年,樣品編號(hào)為 S1~S31,詳見表1。
對照品(純度≥98%):蕓香苷(批號(hào):20210507)、根皮苷(批號(hào):20201106)、表沒食子兒茶素(批號(hào):20200903)、綠原酸(批號(hào):20210531)、柚皮苷(批號(hào):20201106)、沒食子酸(批號(hào):20200317)、原兒茶酸(批號(hào):20201120)、咖啡酸(批號(hào):20201106),均購自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院;對羥基苯甲酸(批號(hào):PCS-210611)、異葒草素(批號(hào):PCS-201109)、阿魏酸(批號(hào):PCS-210803)、異阿魏酸(批號(hào):PCS-210309)、藜蘆酸(批號(hào):PCS210309)、肉桂酸(批號(hào):PCS-210412)、山柰酚(批號(hào):PCS-200710)、香蘭素(批號(hào):PCS-210419)、香草酸(批號(hào):PCS-201205),均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。
試劑:甲醇和甲酸均為色譜純,水為超純水。
1.1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀(e2695),購自沃特世上??萍加邢薰荆皇f分之一分析天平(CP225D),購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;超聲波清洗器(KQ-500E),購自昆山市超聲儀器有限公司;刀式混合研磨儀(GM 200),購自弗爾德萊馳(上海)貿(mào)易有限公司。
1.2.1 供試品溶液的制備 將干燥過后的藜麥樣品研磨過0.25 mm篩,精確稱量1.000 g,置于5 mL容量瓶中,加入甲醇至刻度線,搖勻并精確稱量后,超聲處理1 h(功率500 W,頻率40 kHZ),取出冷卻后再補(bǔ)足甲醇質(zhì)量,搖勻,靜置30 min,取上層清液過0.22 μm濾膜,所得濾液即為供試品液。
1.2.2 混合對照品溶液的制備 精確稱取蕓香苷、根皮苷、表沒食子兒茶素、綠原酸、柚皮苷、沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸,藜蘆酸、肉桂酸、山柰酚、香蘭素和香草酸適量,置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成對照品母液,按比例稀釋得2、4、8、12、16、20 mg/L的混合對照品貯備液,經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后,進(jìn)行HPLC分析。
1.2.3 色譜條件 安裝PE色譜柱(Quasar AQ C18柱250 mm×4.6 mm,5 μm),流速:0.8 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長247 nm,進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相:甲醇(A)、0.2%甲酸溶液(B),梯度洗脫程序見表2。
1.2.4 方法學(xué)考察
1.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S1適量,按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,以分離度較好、峰面積較大、峰位相對居中的異阿魏酸峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。
1.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取樣品S1適量,平行取6份,按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,以異阿魏酸峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD。
1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取樣品S1適量,分別于制備后0、2、4、8、12、16、24 h,按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定,記錄指紋圖譜,以32.065 min共有色譜峰為參照峰,計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD。
1.2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取藜麥樣品S1 6份,每份 1.00 g,置于100 mL容量瓶中,加入混合標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液1 mL,用70%甲醇溶液定容至100 mL,同時(shí)按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定,記錄表沒食子兒茶素、對羥基苯甲酸、綠原酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸、蕓香苷、根皮苷的加標(biāo)回收率和RSD。
采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)繪制山西藜麥指紋圖譜,并進(jìn)行相似度分析;利用統(tǒng)計(jì)分析軟件IBM SPSS 22.0對31份藜麥樣品進(jìn)行聚類分析和主成分分析;利用SIMCA 14.1軟件對其進(jìn)行偏最小二乘判別分析。
精密度試驗(yàn)結(jié)果相似度在0.999以上,各共有峰的相對保留時(shí)間RSD小于0.048%,相對峰面積RSD小于1.896%;重復(fù)性試驗(yàn)中,以異阿魏酸峰為參比峰,相似度在0.999以上,各共有峰的相對保留時(shí)間RSD小于0.053%,相對峰面積RSD小于1.304%;穩(wěn)定性試驗(yàn)中,相似度在0.999以上,各共有峰的相對保留時(shí)間RSD小于0.048%,相對峰面積RSD小于1.083%;加樣回收率結(jié)果相似度在0.999以上,表沒食子兒茶素、對羥基苯甲酸、綠原酸、異葒草素、阿魏酸、異阿魏酸、蕓香苷、根皮苷的回收率分別為103.95%、101.85%、102.50%、101.83%、102.10%、100.13%、101.02%、102.22%,RSD分別為4.67%、3.98%、2.84%、3.01%、2.68%、1.76%、3.83%、2.08%。結(jié)果表明,HPLC儀器精密度良好,試驗(yàn)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性準(zhǔn)確度良好,供試品溶液在室溫下 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜的要求。
分別取31批山西藜麥樣品,按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,另取12 mg/L的混合對照品溶液,按“1.2.3”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定,記錄供試品和混合對照品的色譜圖。將得到的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版),選擇色譜峰分離度較好、峰面積占比較高且比較穩(wěn)定的S16為參照圖譜,中位數(shù)對照圖譜生成方式,時(shí)間窗寬度選0.15 min,然后采用多點(diǎn)校正進(jìn)行全峰自動(dòng)匹配,生成山西藜麥HPLC對照指紋圖譜,確定了22個(gè)共有峰,可以構(gòu)成指紋圖譜的共有模式,結(jié)果見圖1、圖2。通過與已知標(biāo)準(zhǔn)品對照得知,圖2中6號(hào)峰是表沒食子兒茶素,7號(hào)峰是對羥基苯甲酸,9號(hào)峰是綠原酸,14號(hào)峰是異葒草素,15號(hào)峰是阿魏酸,16號(hào)峰是異阿魏酸,18號(hào)峰是蕓香苷,19號(hào)峰是根皮苷。
將31批藜麥樣品指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版),進(jìn)行相似度分析,確定了22個(gè)共有峰。圖3為31批樣品匹配后的疊加色譜圖,相似度計(jì)算結(jié)果見表3。由表3可以看出,31批樣品的相似度除S8和S9以外其余均大于0.84,說明山西各產(chǎn)地藜麥有較好的一致性,可以用于綜合評價(jià)山西藜麥的整體質(zhì)量。
表3 31批藜麥樣品相似度分析結(jié)果
取31批藜麥樣品,按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液,在“1.2.3”節(jié)中的色譜條件下,測定8種有效成分的含量,測定結(jié)果見表4。
2.5.1 聚類分析 將31批藜麥樣品的22個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0,利用系統(tǒng)聚類分析法,選取組間連接、平方歐氏(Euclidean)距離進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示,當(dāng)閾值T=10時(shí),31批樣品可大致分為4類,其中S1~S6、S12、S14~S16、S18~S22、S24、S26和S27聚為一類,S7、S10、S11、S13、S23、S25、S28~S31聚為一類,S8和S9各單獨(dú)成一類。說明山西省各地之間的藜麥也存在一定的差異,尤其是品種不同差異較大。
表4 8種成分含量測定結(jié)果
表4(續(xù))
2.5.2 主成分分析 將31批藜麥樣品中22個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0,進(jìn)行PCA標(biāo)準(zhǔn)化處理,計(jì)算得到相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率和主成分綜合得分等。
2.5.2.1 相關(guān)性分析 相關(guān)系數(shù)矩陣見表5。結(jié)果顯示9號(hào)色譜峰(綠原酸)和10號(hào)色譜峰相互之間有較大的正相關(guān)性;11號(hào)色譜峰和13號(hào)色譜峰相互之間有較大的正相關(guān)性。
2.5.2.2 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率 計(jì)算得到的主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率見表6,碎石圖見圖5。以基于特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn),得到主成分分析結(jié)果。由表6可知,前7個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.301%,說明所提取的前7個(gè)主成分即可代表山西藜麥指紋圖譜中的22個(gè)成分量的信息,從而評價(jià)山西藜麥的質(zhì)量情況。由圖5可以看出,在主成分8處開始出現(xiàn)明顯拐點(diǎn),前7個(gè)主成分可以對藜麥質(zhì)量進(jìn)行評價(jià),該結(jié)果與表6中的結(jié)果一致。
初始因子載荷矩陣見表7,載荷圖見圖6,它們反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)程度。由表7和圖6可知,第1主成分主要反映9、10、16和17號(hào)峰的主要信息;第2主成分主要反映3、5、11、13、15和18號(hào)峰的主要信息;第3主成分主要反映6、8和14號(hào)峰的主要信息;第4主成分主要反映19號(hào)峰的主要信息;第5主成分主要反映1和2號(hào)峰的主要信息;第6主成分主要反映7、20和21號(hào)峰的主要信息;第7主成分主要反映4、12和22號(hào)峰的主要信息。其中已標(biāo)定的峰9(綠原酸)和峰16(異阿魏酸)落在第1主成分,峰15(阿魏酸)和峰18(蕓香苷)落在第2主成分,峰6(表沒食子兒茶素)和峰14(異葒草素)落在第3主成分,峰19(根皮苷)落在第4主成分,說明已標(biāo)定的幾個(gè)色譜峰在山西藜麥中比較穩(wěn)定,對山西藜麥主成分的貢獻(xiàn)率比較大,在決定不同批次間山西藜麥質(zhì)量差異上有著重要作用。
表5 相關(guān)系數(shù)矩陣
2.5.2.3 主成分綜合評價(jià)得分 以7個(gè)主成分得分與其方差貢獻(xiàn)率乘積之和,得出不同產(chǎn)地藜麥31個(gè)樣品的主成分綜合評價(jià)得分(綜合評價(jià)得分方程為F=25.002%F1+17.399%F2+12.982%F3+9.865%F4+7.996%F5+5.466%F6+6.591%F7)及排序,得分越高說明該樣品在代表性主成分中綜合質(zhì)量越好。由表8可知,31個(gè)樣品中S24、S21、S16、S23、S6、S2、S1和S20的質(zhì)量相對較優(yōu)。
表6 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率
2.5.2.4 正交偏最小二乘判別分析 以藜麥樣品22個(gè)共有峰峰面積為變量系數(shù),將其導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA,比較31個(gè)藜麥樣品之間的差異,得到VIP預(yù)測值,篩選出差異性化合物[12]。由圖7可以看出,以 VIP>1.0為閾值,篩選出6個(gè)峰,分別是色譜峰16(異阿魏酸)、14(異葒草素)、1、17、19(根皮苷)、15(阿魏酸),可作為山西藜麥質(zhì)量控制的標(biāo)志物,同時(shí)這幾個(gè)成分對區(qū)分山西藜麥樣品的產(chǎn)地貢獻(xiàn)也較大。
本研究用甲醇超聲提取藜麥樣品,對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇,確定了最佳的色譜條件,選取在247 nm波長處對山西藜麥樣品指紋圖譜進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率的方法學(xué)考察。基于HPLC技術(shù)建立了山西藜麥指紋圖譜并進(jìn)行分析,31批山西藜麥樣品中確定了22個(gè)共有峰,通過與已知標(biāo)準(zhǔn)對照品比對,指認(rèn)了8個(gè)色譜峰。通過對31批山西藜麥樣品進(jìn)行了相似度評價(jià),結(jié)果表明除S8和S9以外其余樣品的相似度均在0.84以上,說明山西各產(chǎn)地藜麥成分有較高的相似度,各成分差異不太明顯,各共有峰相對保留時(shí)間比較接近,相對峰面積差異較大,說明山西不同產(chǎn)地藜麥各成分含量存在差異。因黑藜麥和紅藜麥采集樣較少,代表性不足,下一步將重點(diǎn)進(jìn)行研究。
以22個(gè)共有峰面積為變量進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,HCA 和PCA結(jié)果顯示31批山西藜麥樣品聚為4類,且同一地區(qū)藜麥樣品也不一定歸為一類,這可能與藜麥品種、產(chǎn)地、氣候環(huán)境等多種因素有關(guān),尤其是品種不同,差異較大。主成分分析提取到7個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.301%,可代表山西藜麥指紋圖譜中主要成分含量信息。主成分綜合評價(jià)結(jié)果顯示,樣品S24、S21、S16、S23、S6、S2、S1和S20的得分比較靠前,說明其質(zhì)量相對較優(yōu)。OPLS-DA結(jié)果顯示,通過VIP預(yù)測值排序,篩選出差異性化合物6種成分,分別是色譜峰16(異阿魏酸)、14(異葒草素)、1、17、19(根皮苷)、15(阿魏酸),可作為山西藜麥質(zhì)量控制的標(biāo)志物,同時(shí)這幾個(gè)成分對區(qū)分山西藜麥樣品的產(chǎn)地貢獻(xiàn)也較大。
綜上,本研究基于HPLC建立了山西省不同地區(qū)藜麥HPLC指紋圖譜,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對31批樣品進(jìn)行相似度分析、HCA、PCA和OPLS-DA,研究結(jié)果可為山西藜麥產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制提供有力的參考依據(jù)。
表7 初始因子載荷矩陣
表8 主成分得分、綜合得分及排序