尚曉靜，侯 瑞，徐芳玲，潘秋梅，張富美

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.黔東南州林業(yè)科學(xué)研究所，貴州凱里 556000)

藍莓(Vacciniumspp.)是多年生灌叢類果樹，為杜鵑花科越橘屬，根毛少、根淺。適宜生存在土質(zhì)疏松，土壤微酸的環(huán)境中[1]。我國于20世紀末在貴州省黔東南苗族侗族自治州麻江縣開始大規(guī)模引種、種植藍莓，因環(huán)境適宜，貴州藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[2]。磷在植物的生長發(fā)育過程中扮演著非常重要的角色，為植物生長必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素[3-4]。土壤中磷的主要形態(tài)可以分為有機態(tài)和無機態(tài)2種。目前已發(fā)現(xiàn)的有機態(tài)磷主要包括代謝磷酸鹽、磷酸化蛋白、磷脂、核酸和肌醇磷酸鹽等[5]。

在土壤里，溶磷菌能把不利于植物吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為易于其吸收利用的形態(tài)[6]。溶磷真菌類菌株種類較少，主要有小菌核屬(Sclerotium)、青霉屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬(Aspergillus)。這5類菌株中，曲霉屬菌株的溶解活性效果最好[7]。目前，國外已對曲霉屬一類的溶磷菌做了廣泛深度的探索[8]。李露莉等在研究黑曲霉的試驗中發(fā)現(xiàn)其具有改良一些品位不好的磷礦石的作用[9]。梁艷瓊等從熱帶作物根際以及鹽堿地檸條根圍土壤中分離出具有溶磷作用的曲霉[10-11]。張建峰等通過篩選得到了1株繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)，其溶磷能力較好，能將直徑為9 cm的無機磷固體培養(yǎng)基在96 h后完全溶解[12]。范延輝等篩選出1株耐鹽溶磷的真菌PSF2，該菌株在NaCl濃度為0.45%的土壤中培養(yǎng)20 d后，土壤中有效磷含量提高了20.9%[13]。

目前，已經(jīng)篩選出大量的溶磷微生物，但其中具有耐鹽性的不多，不一定適合在鹽漬化土壤中生存。因此，尋找并發(fā)現(xiàn)既能溶磷又耐鹽的真菌，將其應(yīng)用于鹽堿地農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和土壤環(huán)境改良是很有必要的。本試驗通過常規(guī)固體篩選和鉬銻抗比色法等方法，初步篩選出具有溶磷特性的藍莓溶磷內(nèi)生真菌，鑒定溶磷內(nèi)生真菌，分析菌株耐鹽性并研究其溶磷特性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 本試驗于2019年在貴州大學(xué)林學(xué)院森林保護學(xué)實驗室研究，供試菌株為貴州大學(xué)林學(xué)院森林保護學(xué)實驗室從藍莓根、葉、果實分離得到的內(nèi)生真菌菌株(G14、FG54)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL 水，自然pH值。馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中去掉瓊脂。無機磷(PKO)培養(yǎng)基：3.0 g Ca3(PO4)2，10.0 g蔗糖，0.5 g NaCl，0.2 g KCl，0.1 g (NH4)2SO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.004 g MnSO4，0.5 g酵母膏，0.004 g FeSO4，1 000 mL蒸餾水，15.0 g瓊脂，pH值為7.0。蒙金娜有機磷培養(yǎng)基：10g葡萄糖，0.5 g (NH4)2SO4，0.3 g NaCl，0.3 g KCl，0.2 g卵磷脂，0.3 g MgSO4·7H2O，0.03 g FeSO4·7H2O，0.03 g MnSO4·4H2O，5 g CaCO3，0.4 g酵母膏，20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值為7.0。耐鹽性培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加上不同含量NaCl。水-瓊脂(WA)培養(yǎng)基：20 g瓊脂，1 000 mL 水，pH自然。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃、30 min高溫滅菌處理。

1.1.3 主要試劑 2，4-二硝基酚指示劑：0.25 g二硝基酚定容至100 mL蒸餾水中。標準磷溶液：放置KH2PO4在45 ℃環(huán)境干燥 6 h 后稱取0.439 4 g，移至400 mL蒸餾水中充分溶解，加入5 mL濃硫酸，用蒸餾水稀釋至1 L，搖勻。鉬銻抗貯存液：配制質(zhì)量濃度為0.5%的酒石酸銻鉀(C8H4K2O12Sb2)的溶液。另取10 g鉬酸銨(H8MoN2O4)于 450 mL 蒸餾水中混勻，慢慢添加153 mL濃硫酸并攪動。最后，在鉬酸銨溶液中添加100 mL濃度為0.5%的酒石酸銻鉀溶液，蒸餾水定容至1 L并混勻，儲藏于深棕色瓶子里。鉬銻抗顯色劑：臨用前于100 mL鉬銻抗貯存液中加入1.5 g左旋維生素C。5 mg/L磷溶液：臨用前取10 mL上述100 mg/L標準磷溶液置于量筒中，用蒸餾水定容至200 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓內(nèi)生真菌的分離與純化 無菌條件下，將取到的新鮮的藍莓植株的根、葉、果等3個部位分別用無菌水緩慢沖洗3次，去除表面雜質(zhì)，用體積分數(shù)為75%的乙醇消毒2～3 s，用無菌水潤洗3遍后用體積分數(shù)為3% NaClO浸泡3 min，再用無菌水潤洗5～8次。已消毒后的根、葉、果等3個部位分別在PDA培養(yǎng)基上滾動并取出作為對照。截取邊長為0.5 cm的根、葉、果小塊接種在PDA 培養(yǎng)基上于 28 ℃ 下培養(yǎng)。根、葉、果周圍有菌絲長出時，分別挑取菌絲轉(zhuǎn)移至未接菌的PDA培養(yǎng)基上進一步純化，以每個平板上只含有同一個特征的單一菌落作為試驗結(jié)束的標志。

1.2.2 藍莓溶磷內(nèi)生真菌篩選 將已活化的內(nèi)生真菌(菌柄直徑d=0.6 cm) 分別接種在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基和PKO培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng) 72 h 后，根據(jù)是否存在透明溶磷圈來判定菌株是否具備溶磷能力；同時測定菌株的溶磷圈直徑D值與d值并計算比值，把具有可溶磷的菌株初步篩選出來。

1.2.3 藍莓溶磷內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定 無菌條件下，用6.0 mm打孔器依次取菌株G14、FG54置于PDA培養(yǎng)基中，觀察菌落2、4、6 d后的生長變化及菌落特征，對菌株進行簡單的形態(tài)學(xué)鑒定。挑取培養(yǎng)皿新鮮菌絲置于放有載玻片的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng) 3～4 d時，在邊緣菌絲上蓋上蓋玻片，通過熒光顯微鏡觀察菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征并拍照。

1.2.4 藍莓溶磷內(nèi)生真菌DNA分子生物學(xué)鑒定 無菌環(huán)境下分別取菌株G14、FG54 菌餅放入PDB中，于28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36 h，利用真菌提取試劑盒進行提取菌株總DNA，用ITS1和ITS4擴增18S rDNA 的ITS區(qū)域，提取獲得的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增產(chǎn)物委托重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。獲得的DNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫用基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)進行序列比較分析，利用MEGA 7.0軟件的Clustalw程序進行多序列比對并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的溶磷效果測定 以PKO培養(yǎng)基不加瓊脂作為液體培養(yǎng)基，每個錐形瓶各添加150 mL，無菌條件下，取5塊直徑8.0 mm的菌餅分別放入呈有發(fā)酵液的錐形瓶中，移至搖床，于28 ℃、150 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)后每天取樣測定發(fā)酵液中有效磷含量，同時測定pH值。

發(fā)酵液有效磷含量的測定：取5 mL上清液，12 000 r/min 離心5 min后，取3 mL上清液作為待測液置于50 mL錐形瓶中。

磷標準液的配制：將100 mg/L的磷標準溶液稀釋至5 mg/L，分別取0、2、4、6、8、10 mL的5 mg/L 的磷標液至50 mL 錐形瓶中，添加蒸餾水至30 mL。

上述溶液均加2滴2，4-二硝基酚指示劑，再逐滴加入4 mol/L NaOH溶液至錐形瓶內(nèi)液體變?yōu)槲ⅫS色；然后添加1 mol/L H2SO4溶液至黃色褪去，分別添加5 mL鉬銻抗顯色劑，快速搖勻后，加蒸餾水至50 mL標線位置，2 h后用分光光度計測定 700 nm 處吸光度值。以未接菌的PKO液體發(fā)酵液為參比液，設(shè)定其吸收值為0，分別測定不同標準液和發(fā)酵液的顯色值，繪制磷標準曲線，并在磷標準曲線上計算發(fā)酵液的磷濃度。計算公式為

有效磷含量(μg/mL)=(ρ×V×Ts)/Vo。

式中：ρ表示有效磷的質(zhì)量濃度，μg/mL；V表示定容體積，mL，此處為50 mL；Ts為分取倍數(shù)，此處為17倍；Vo表示加入發(fā)酵液的體積，mL，此處為3 mL。

1.2.6 藍莓溶磷菌分泌有機酸的種類及含量測定 分別取3片已活化的G14和FG54菌柄(d=5 cm)至PKO液體培養(yǎng)基中，置于120 r/min、25 ℃搖床培養(yǎng)7 d后，于離心機離心后取上清液，用1290 Infinity型超高效液相色譜儀(上海硅儀生化科技有限公司)測定有機酸的種類及含量。液相色譜條件：色譜柱為C18(粒徑1.8 μm，內(nèi)徑×長度2.1 mm×100 mm)；流動相A為超純水(含0.1% 的甲酸)；流動相B為乙腈(含0.1%的甲酸)；儀器柱溫為 40 ℃；流速為 0.40 mL/min；進樣體積為2 μL。

1.2.6 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的耐鹽性分析 采用PDA 作為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別加入含量為0%、2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%的NaCl。無菌條件下，取直徑為6.0 mm的菌株菌餅接種在不同NaCl含量的培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄菌絲在不同NaCl 含量的PDA平板上的蔓延情況分析菌株耐鹽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的篩選與鑒定

2.1.1 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的篩選 以PKO固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌2 d后觀察透明圈情況，再結(jié)合溶磷圈篩選法進一步篩選出具有溶磷特性的菌株。G14和FG54溶磷效果見圖1，初步顯示G14、FG54菌株均能溶解有機磷和無機磷。

2.1.2 G14、FG54菌株在不同溶磷培養(yǎng)基中的溶磷圈比較 經(jīng)反復(fù)篩選得到的溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的值(表1)，其中2個培養(yǎng)基中G14的D/d最大。蒙金娜培養(yǎng)基中G14的D/d為1.7，F(xiàn)G54為1.1。PKO培養(yǎng)基中，G14的D/d最大，為1.7，F(xiàn)G54的D/d為1.6。2株菌株于蒙金娜和PKO培養(yǎng)基中生長速度與溶磷圈大小各不相同，推測2株菌株對同一培養(yǎng)基的溶磷性與溶磷機制不同。

2.2 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的鑒定

2.2.1 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的PDA形態(tài)學(xué)觀察 由圖2可知，菌株G14于28 ℃下暗培養(yǎng)，其生長速度較快，6 d后可鋪滿培養(yǎng)皿平面(直徑90 mm)。菌落邊緣整齊，紋理松散；菌絲生長均勻，表面呈白色棉絮狀。菌落邊緣在顯微鏡下呈分枝狀生長，具有鎖狀聯(lián)合。菌株FG54于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng) 6 d 后形成半徑為4.0～4.5 cm 的菌落，F(xiàn)G54生長較緩慢，每天均勻生長，菌落正面整體為圓形，中央為淺青色環(huán)繞，邊緣為白色細菌絲，菌落背面為淺黃色，呈褶皺狀生長。菌株FG54菌落邊緣顯微形態(tài)特征，顯微鏡下該菌株菌絲頂端產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)呈掃帚狀。

表1 溶磷菌株溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)

2.2.2 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的DNA分子生物學(xué)鑒定 將菌株G14、FG54進一步測序。菌株G14總DNA經(jīng)過ITS1和ITS4引物擴增，PCR產(chǎn)物送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測序得到相關(guān)序列。獲取測序結(jié)果后登錄 GenBank，得到登錄號 MT601950。將菌株G14序列進行BLAST 比對結(jié)果表明菌株G14與BjerkanderaadustaKJ668570.1的親緣關(guān)系達到100%，菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。同時，獲取菌株FG54測序結(jié)果后登錄 GenBank，得到登錄號 MT601884。FG54與PenicilliumadametziiKF313079.1的親緣關(guān)系為100%，將其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

2.3 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的溶磷效果測定

2.3.1 藍莓溶磷內(nèi)生真菌有效磷含量變化 以PKO為參比液，在Excel 中輸入磷標線數(shù)據(jù)，計算得磷標線公式為y=0.374 3x+0.017 9，r2=0.992。通過公式算得的有效磷含量(μg/mL)。由圖5可知，F(xiàn)G54有效磷含量總體表現(xiàn)為先降后升再降的趨勢，2～5 d的有效磷含量逐漸上升，5 d達到最大值587.315 μg/mL，7 d 降到404.465 μg/mL。G14的有效磷含量表現(xiàn)為先降再升再降的趨勢，G14從1 d的331.628 μg/mL下降到2 d的187.131 μg/mL，然后一直上升，在5 d達到最大，最大值為 523.730 μg/mL，過后逐漸呈現(xiàn)下降的趨勢，到7 d降至117.742 μg/mL。菌株G14、FG54有效磷含量均在1～2 d呈現(xiàn)下降趨勢，3～5 d有效磷含量值都在逐步上升，總體都在5 d達到最大有效磷含量，并在5 d后逐步下降，G14的1 d的值比7 d的值高，而FG54的7 d值比1 d高。

2.3.2 藍莓溶磷內(nèi)生真菌發(fā)酵液中pH值的變化 由圖6可知，PKO液體的7 d時pH值大于G14、FG54。PKO的pH值在前3 d呈現(xiàn)逐步上升趨勢，3 d 達到最大值6.40，4 d逐步下降，7 d降至5.25。G14在2 d pH值下降，3 d又回升到最大值，4 d逐漸下降，5 d下降速度最快，7 d下降至4.52。FG54 pH值在2 d達到最大，為5.97，之后逐步下降。2個菌株的pH值均低于PKO值，且所有的發(fā)酵液在5 d下降的速度最快。喬歡等研究得出pH值與磷的溶解量呈負相關(guān)關(guān)系，隨著磷溶解量的增加，pH值隨之降低[14]。本研究結(jié)果與之相符，通過監(jiān)測2株溶磷內(nèi)生真菌在5 d時有效磷含量值達到峰值。

2.4 藍莓溶磷菌分泌有機酸的種類及含量測定

對2株菌株的有機酸種類及含量進行測定，得出2株藍莓溶磷菌分泌的有機酸種類及其相對含量，根據(jù)數(shù)據(jù)庫物質(zhì)中2株菌共同分泌有機酸種類進行篩選，匹配到的有機酸共3種(表2)。有機酸種類依據(jù)相對含量大小排列分別為丙二酸、甲基丙二酸和檸檬酸。

表2 藍莓溶磷菌代謝產(chǎn)物的種類及其相對含量

2.5 藍莓溶磷內(nèi)生真菌的耐鹽性分析

通過5 d觀察記錄到的G14、FG54在不同NaCl含量下的菌絲平均直徑(mm)情況見表3。由于菌絲前2天生長速度緩慢，故不記錄菌絲直徑，未生長用“—”表示。由表3可知，總體上FG54能適應(yīng)不同含量的NaCl濃度，G14的最高耐鹽濃度是2.50%，F(xiàn)G54相較G14來說耐鹽適應(yīng)范圍更廣一些。FG54在NaCl含量為2.50%的時候生長效果最好，在0%和5%時效果次之，12.5%最差。在 3 d 時12.5% NaCl含量下，F(xiàn)G54生長速度較緩慢，其直徑僅增加1 mm左右。同樣取菌株G14直徑 6 mm 的菌塊置于相同培養(yǎng)基，在NaCl含量為0%和2.5%下，3 d時菌絲直徑能生長到FG54的 1～3倍數(shù)，但當NaCl含量大于2.5%時，G14皆不生長。綜上所述，2類菌絲的耐鹽程度較低，經(jīng)觀察低NaCl含量下，G14的5 d后的生長速度遠超于FG54。

表3 不同NaCl含量下的菌絲直徑情況

3 討論與結(jié)論

微生物肥料能夠有效改良土壤的肥力與結(jié)構(gòu)，使作物更高效地利用土壤里的化肥，增強作物的抗逆性，提高作物的產(chǎn)量，且對環(huán)境污染較小，故溶磷微生物在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上十分重要[15]。溶磷菌的溶磷機制較為復(fù)雜，溶磷菌在培養(yǎng)的過程中可分泌多種有機酸，有機酸可以溶解磷化物[16]。而不同溶磷菌所分泌的有機酸類型可能存在區(qū)別，且培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的有機酸種類也可能不同[17-18]。通過對2株菌株的有機酸種類及含量的分析，丙二酸、甲基丙二酸和檸檬酸為本試驗研究的2株溶磷菌的主要有機酸代謝產(chǎn)物。本試驗把菌株FG54和G14接種到蒙金娜有機磷培養(yǎng)基和PKO無機磷培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)2株菌株均能產(chǎn)生溶磷圈，說明2株菌株均具有溶磷功能[19]。菌株FG54是阿達青霉，培養(yǎng)5 d其有效磷含量為587.315 μg/mL，溶磷效果較同為青霉屬的嗜松青霉JP-NJ4溶磷效果低，嗜松青霉JP-NJ4在磷酸鈣溶液中溶磷量為 1 390 mg/L[14]。溶磷菌的溶磷機制是溶磷菌產(chǎn)生的質(zhì)子降低了培養(yǎng)基的 pH值，從而使磷酸鹽溶解[20]。據(jù)現(xiàn)有報道，諸多植物根際分布的微生物類群能產(chǎn)生植物激素，促進植物根部細胞的生長，增加植物對營養(yǎng)元素的吸收能力[21]。Illmer等從不同植株中篩選到高校溶磷菌株后，又對菌株的溶磷能力、培養(yǎng)特性等做了深入的研究，發(fā)現(xiàn)不同菌株其溶磷能力不同[22-25]。在pH值與溶磷能力的關(guān)聯(lián)性研究中，本試驗結(jié)果與馮宏等研究結(jié)果不同的是，其研究的菌株培養(yǎng)液的 pH 值與溶磷能力并無顯著關(guān)聯(lián)性[26]，而本試驗研究2個菌株在培養(yǎng)時隨酵液中的pH值的降低，有效磷含量隨之升高，因此推測本試驗的2株菌株能起到溶磷作用的主要原因是其質(zhì)子產(chǎn)生時的酸解作用[22]。本試驗中有效磷含量總體表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，F(xiàn)G54菌株5 d有效磷含量最高，而G14稍微低一些，可能是各個菌株在同一種溶液中的溶解能力、溶解機理存在差異。菌株的耐鹽性也是菌株在生產(chǎn)應(yīng)用上的關(guān)鍵因素。楊榕等發(fā)現(xiàn)其研究的長枝木霉隨著鹽脅迫濃度的提高，菌株的生長速度和溶磷性均有所降低，因此在實際農(nóng)業(yè)應(yīng)用過程中需判斷土壤的鹽濃度含量，鹽濃度含量過高時會抑制部分菌的生長[27]。

本試驗結(jié)果表明，菌株FG54和G14的生長都受NaCl含量的影響，菌株FG54在NaCl含量為2.50%的時候生長效果最好，而當NaCl濃度達到12.50%時生長效果變差。菌株G14只能在NaCl含量為0%和2.50%的條件下生長，在大于2.50%的條件下皆不生長。向文良等分離出的嗜鹽溶磷菌QW1011，在NaCl濃度為10%下生長狀態(tài)最好，且對NaCl最高耐受濃度可達15%[28]，與之相比，本試驗篩選的2株菌株的耐鹽性較低。綜合耐鹽性分析，本試驗分離出的菌株FG54對土壤的耐鹽性較高，對當今的土壤出現(xiàn)的各種狀況可以起到一定的改良作用。而菌株G14耐鹽性相對較差，適合在NaCl濃度較低的土壤上應(yīng)用。本試驗為進一步研究溶磷內(nèi)生真菌在土壤中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為鹽堿地農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和土壤環(huán)境改良上提供應(yīng)用依據(jù)。