彭 嬋，張新葉，劉宗坤，馬林江，陳慧玲

（1黃岡師范學(xué)院/經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大別山特色資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡 438000；2湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，武漢 430075；3湖北宗坤石斛科技開發(fā)有限公司，湖北英山 438700）

0 引言

石斛屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)第二大屬，全球約1500多種，廣泛分布于亞洲熱帶、大洋洲和澳大利亞等地區(qū)[1]。中國約有81種2變種，其中霍山石斛(Dendrobium huoshanense)、鐵皮石斛(D.officinale)等18種為國內(nèi)特有種[2]。石斛屬植物按功能通常分為觀賞石斛和藥用石斛[3]，其中觀賞石斛是最受歡迎的盆栽植物之一[4]，具有獨(dú)特的花形和花香[5]，被廣泛用于切花、盆花[6]的生產(chǎn)。藥用石斛在中國始載于秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]，此后許多古代藥典均有記載，其具有補(bǔ)五臟虛勞、養(yǎng)腎氣、益力等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明石斛屬植物富含多糖、生物堿、黃酮苷等各類有機(jī)物，具有降糖[8]、降脂[9]、抗氧化[10]、護(hù)肝腎[11-12]、改善高血壓[13]、抗腫瘤[14-15]等作用，在許多疾病的治療上應(yīng)用潛力巨大，系《中國藥典》國家基本藥物名錄收載品種，2020年1月6日又被國家衛(wèi)健委列入《黨參等9種試點(diǎn)按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)名單》[16]，由于石斛屬植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其野生資源遭到過度采挖甚至瀕危，利用分子生物學(xué)技術(shù)對石斛開展遺傳學(xué)研究對其物種保護(hù)與種質(zhì)資源利用意義重大。

目前被開發(fā)并且應(yīng)用在石斛屬中的遺傳標(biāo)記有RAPD[17]、ISSR[18]、SRAP[19]、SSR[20]、TRAP 和 SCAR[21]等，其中SSR標(biāo)記因變異度、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被作為國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)新品種DUS測試的理想標(biāo)記[22]，也被成功應(yīng)用于重要經(jīng)濟(jì)林木非法砍伐執(zhí)法舉證[23]等各類植物研究中。SSR標(biāo)記對于石斛屬主要應(yīng)用在遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究、種質(zhì)資源的鑒定、遺傳圖譜和指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源與純度鑒定等方面。筆者以近年來SSR標(biāo)記在石斛屬中的研究與應(yīng)用為中心進(jìn)行綜述，以期為今后SSR標(biāo)記在石斛屬中的深入應(yīng)用提供參考。

1 遺傳多樣性研究

Gu[24]和Fan[25]等應(yīng)用磁珠富集法分別設(shè)計(jì)出鐵皮石斛和流蘇石斛(D.fimbriatum)的SSR標(biāo)記引物并檢測到高水平遺傳多樣性，哈溫平衡和連鎖不平衡計(jì)算證明這些引物標(biāo)記在石斛種群水平上有應(yīng)用潛力。通常遺傳多樣性越高的物種其穩(wěn)定性與進(jìn)化潛力越大，石斛屬植物是重要的中藥材，在國內(nèi)其野生資源面臨逐年減少或枯竭的危險(xiǎn)，針對遺傳多樣性制訂相應(yīng)的保護(hù)和利用策略對于石斛屬資源開發(fā)具有重要意義。近年來利用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行石斛野生資源遺傳多樣性研究有一些報(bào)道，如Cai等[26]研究了粉花石斛9個(gè)野生居群96個(gè)個(gè)體，發(fā)現(xiàn)其具有較高遺傳多樣性，推測認(rèn)為導(dǎo)致野生粉花石斛(D.loddigesii)群體顯著減少的原因非自身遺傳基礎(chǔ)而是人為破壞。Yan等[27]研究中國東南地區(qū)野生金釵石斛(D.nobile)發(fā)現(xiàn)了較高的遺傳多樣性，7個(gè)SSR標(biāo)記檢測出平均觀察等位基因范圍為0.53～0.79，平均期望雜合度范圍為0.64～0.9，但海南島居群較大陸居群的遺傳多樣性低而遺傳分化度高，可能面臨瀕危風(fēng)險(xiǎn)。鄭基陽等[28]利用12對引物檢測安徽霍山縣野生霍山石斛居群24份樣品，平均等位基因數(shù)為5.4，平均觀察雜合度為0.500，平均預(yù)期雜合度為0.638，分析結(jié)果認(rèn)為該種群可能存在近親繁殖現(xiàn)象，此后Wang[29]對霍山石斛自然居群的研究結(jié)果也與之相似。Hou[30]比較了浙江、福建、云南鐵皮石斛野生居群個(gè)體和種質(zhì)資源庫樣本的遺傳多樣性差異，發(fā)現(xiàn)野生居群等位基因多樣性高于資源庫樣本，但資源庫樣本所含稀有等位基因數(shù)高于野生居群。袁英惠[31]對球花石斛5個(gè)居群共136個(gè)球花石斛(D.thyrsiflorum)個(gè)體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，探討了野生球花石斛日益減少的內(nèi)在原因，為其野生資源的保護(hù)、藥材的道地性和合理開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

2 親緣關(guān)系研究

國內(nèi)石斛屬植物自然分布區(qū)廣泛，種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與其地域分布之間是否存在相關(guān)性有待證實(shí)。蔡小彥[32]利用SSR和SRAP標(biāo)記研究國內(nèi)東南地區(qū)9個(gè)粉花石斛野生居群，2種標(biāo)記結(jié)果均顯示居群間的遺傳距離和實(shí)際的地理距離沒有明顯相關(guān)性。此后較多關(guān)于鐵皮石斛的研究結(jié)果則呈兩極趨勢，如徐蕾等[33]研究來自云南、浙江等地36個(gè)鐵皮石斛野生和栽培居群，大多數(shù)來自不同區(qū)域的鐵皮石斛被分在同一類群中，同一種源地的鐵皮石斛反被分在了不同的類群，種質(zhì)的親緣關(guān)系與種源地之間無直接聯(lián)系。肖冬長等[34]在8個(gè)鐵皮石斛品種的分析也顯示種源之間親緣關(guān)系和種源地聯(lián)系并不緊密，認(rèn)為親緣關(guān)系最近的云南黑節(jié)柴桿和云南廣南軟腳可能與其多糖含量有關(guān)。而趙瑞強(qiáng)[35]研究與前者來源地相似的17個(gè)鐵皮石斛居群則發(fā)現(xiàn)種質(zhì)間親緣關(guān)系與其地理緯度具有顯著的相關(guān)性，同時(shí)用SCoT標(biāo)記也印證了該結(jié)果。董曉曼等[36]基于SSR多態(tài)性標(biāo)記將滇、皖產(chǎn)區(qū)11個(gè)鐵皮石斛人工栽培居群分為3個(gè)類群，聚類結(jié)果顯示地理位置相近的居群遺傳基礎(chǔ)相對接近，有明顯的種源地的地源性親緣關(guān)系。余文霞等[37]對鐵皮石斛9個(gè)產(chǎn)地29個(gè)居群聚類得到4個(gè)類群，各類群表現(xiàn)出較好的地域相關(guān)性，地理位置相近或生長地貌相似的居群遺傳相似度較高。張雅瓊等[38]通過聚類恰好把云南鐵皮石斛栽培變異種與野生種能區(qū)分開，也證實(shí)親緣關(guān)系與其地理種源具有顯著的相關(guān)性。綜上推測石斛種質(zhì)親緣關(guān)系表現(xiàn)與來源地非簡單相關(guān)，或者也受檢測群體數(shù)量以及栽培或野生型影響。

3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜是進(jìn)行植物基因組結(jié)構(gòu)分析和比較研究的重要手段，也是研究優(yōu)良基因定位的基礎(chǔ)，石斛遺傳連鎖圖的構(gòu)建報(bào)道較少，主要是遺傳背景方面的研究還不夠深入，目前石斛遺傳圖譜構(gòu)建研究以多標(biāo)記聯(lián)合作圖為主。汪尚[39]以鐵皮石斛為母本、以鉤狀石斛(D.aduncum)為父本進(jìn)行雜交，獲得石斛的140個(gè)作圖群體F1代，并利用SRAP和SSR標(biāo)記繪制了石斛簡易遺傳圖譜，157個(gè)標(biāo)記構(gòu)成27個(gè)連鎖群，總圖距1580.4 cM，最長的連鎖群為176.9 cM，最短的連鎖群為6.6 cM，平均圖距11.89 cM。潘宏兵[40]選出10對SSR、9條ISSR和67對SRAP多態(tài)性引物用于石斛F1作圖群體的遺傳性狀分離分析，構(gòu)建了含26個(gè)連鎖群的石斛遺傳圖譜，230標(biāo)記位點(diǎn)被定位，圖距總長度為1548.9 cM，連鎖群總長度2230.12 cM。任羽[41]采用“雙假測交”作圖策略，利用SSR、SRAP、RSAP和ISSR標(biāo)記進(jìn)行了石斛蘭遺傳圖譜構(gòu)建研究，該圖譜包括29個(gè)連鎖群，總圖距為1421 cM，標(biāo)記間平均圖距為9.56 cM，連鎖群總長度為1842 cM。

4 DNA指紋圖譜構(gòu)建

國內(nèi)石斛品種多樣，某些品種可能形態(tài)極為相似，且長期生長在相同和相似環(huán)境下的不同品種，在適應(yīng)環(huán)境的過程中也會(huì)出現(xiàn)某些外觀趨同的現(xiàn)象，但其生物學(xué)特性、藥用成分和保健功效卻可能千差萬別，使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)等方法在鑒別區(qū)分上具有局限性，DNA指紋圖譜技術(shù)則為評價(jià)石斛真實(shí)性和證明產(chǎn)品質(zhì)量一致性的有效方法。董曉曼等[36]利用32對SSR引物為11個(gè)滇皖鐵皮石斛居群建立了唯一能夠區(qū)別于其他供試材料的指紋圖譜代碼，為今后鐵皮石斛的品種鑒定提供準(zhǔn)確、可靠的方法及溯源信息平臺。余文霞等[37]利用4對SSR引物構(gòu)建了鐵皮石斛所有主產(chǎn)區(qū)309份樣品的SSR指紋圖譜，可對鐵皮石斛進(jìn)行快速種質(zhì)溯源。劉士輝等[42]對各地搜集的10個(gè)表現(xiàn)優(yōu)良的石斛品種進(jìn)行指紋圖譜鑒定構(gòu)建，從擴(kuò)增出的59條特征條帶中選擇了11條譜帶把供試材料完全區(qū)分開，為產(chǎn)量高、質(zhì)量優(yōu)的品系培育奠定了基礎(chǔ)。張志勇[43]對冠豸山鐵皮石斛5個(gè)野生種源和7個(gè)野生種自然雜交后代進(jìn)行了SSR分析并構(gòu)建了DNA指紋圖譜，該圖譜能夠?qū)邗羯借F皮石斛資源進(jìn)行有效區(qū)分。

5 種質(zhì)資源鑒定

種質(zhì)資源鑒定是植物品種保護(hù)和新品種定向培育的基礎(chǔ)。趙庭梅等[44]利用7對SSR標(biāo)記引物研究鐵皮石斛、疊鞘石斛和金釵石斛共32份材料，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記條帶差異的基因型分型結(jié)果與石斛種內(nèi)材料的表型差異存在一定的相關(guān)性。任羽等[45]通過UPGMA法進(jìn)行聚類將28份石斛蘭種質(zhì)分為5類，聚類結(jié)果與其花色表現(xiàn)出較為密切的關(guān)系，能很好地從分子水平上揭示石斛蘭品種的遺傳背景、親緣關(guān)系，為合理利用石斛蘭種質(zhì)資源培育有更高觀賞價(jià)值的石斛蘭新品種提供理論依據(jù)。張雅瓊[38]基于SSR標(biāo)記檢測和UPGMA聚類，發(fā)現(xiàn)云南省鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)的9個(gè)無性變異分屬于普洱和文山州等3個(gè)不同的種源居群。韓曉霞等[46]對5個(gè)實(shí)生群體的100株鐵皮石斛進(jìn)行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)石斛實(shí)生群體可能來自2個(gè)同源基因庫。章競子[47]以鐵皮石斛、細(xì)莖石斛(D.moniliforme)、齒瓣石斛(D.devonianum)為研究對象，利用SSR標(biāo)記成功將3個(gè)物種劃分為3個(gè)類群實(shí)現(xiàn)種間鑒別。袁英惠[31]在14對微衛(wèi)星引物數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，對國內(nèi)藥材市場上球花石斛12個(gè)加工樣品“黃草石斛”的地理來源進(jìn)行鑒別，GeneClass 2.0和Structure 2.2 2個(gè)軟件得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明SSR標(biāo)記應(yīng)用在種質(zhì)資源鑒定上具有真實(shí)性和可信度。Zhao等[20]構(gòu)建了鐵皮石斛、粉花石斛和銅皮石斛的系統(tǒng)發(fā)育樹，確認(rèn)了物種及其變種的多樣性，并發(fā)現(xiàn)部分SSR引物可用于石斛種內(nèi)遺傳變異鑒定。

6 種質(zhì)純度鑒定

雜交種或組培苗的純度鑒定通常依據(jù)表型判斷，需要在物種特定的種植季節(jié)進(jìn)行，并且易受氣候、生長條件等環(huán)境和人為不確定因素影響，而SSR標(biāo)記技術(shù)則具有操作簡單、準(zhǔn)確性高、檢測重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。謝明璐等[48]將13對種間通用性SSR引物用于鐵皮石斛種質(zhì)純度鑒定和真實(shí)性判別，其中4對能夠檢測鐵皮石斛組培苗的種質(zhì)純度，確定在500株中有497株是同一種質(zhì)品種，其他3株為機(jī)械操作導(dǎo)致的混雜株，品種純度為99%。丁鴿等[49]從10對引物中篩選了3對引物用于晶帽石斛(D.crystallinum)組培苗的純度鑒定，300株組培苗中298株帶型完全相同為同一種質(zhì)，品種純度為99.3%。謝小波等[50]在開展鐵皮石斛原球莖輻照誘變研究中，利用SSR標(biāo)記檢測到原球莖部分經(jīng)輻照發(fā)生了DNA水平變異，且變異發(fā)生程度與輻射劑量存在一定正相關(guān)，真實(shí)反映了SSR標(biāo)記可以用于檢測突變性狀后代遺傳變異情況。李永清等[51]也驗(yàn)證了通過2對SSR標(biāo)記可以成功區(qū)分鐵皮石斛母本與子代。SSR分子標(biāo)記也可有效應(yīng)用于石斛雜交子代真實(shí)性鑒定。李永清[52]采用3對SSR標(biāo)記鑒定鐵皮石斛和霍山石斛正反交F1代植株，63個(gè)子代在正反交真雜種率分別為78.1%和90.3%。劉玉洋[53]對131個(gè)鐵皮石斛和金釵石斛雜交F2代進(jìn)行鑒定，真雜交種占雜交群體的91%。王培育等[54]鑒定鐵皮石斛與金釵石斛雜交F1代和回交后代的真雜種率分別為78.6%和38.9%。

7 展望

SSR分子標(biāo)記具有較低的檢測和應(yīng)用成本、高靈敏度與辨別力、在相近物種中可轉(zhuǎn)移等優(yōu)點(diǎn)，是遺傳基礎(chǔ)理論研究如遺傳多樣性、基因流量、系統(tǒng)進(jìn)化等的重要工具，因其是在基因水平上研究植物多樣性和遺傳關(guān)系，不受環(huán)境因素影響，也是分子輔助育種，如親子關(guān)系分析、雜交測試、連鎖圖譜構(gòu)建、QTL分析、品種指紋圖譜等不可或缺的手段。目前SSR標(biāo)記在石斛屬種質(zhì)鑒定、遺傳作圖、遺傳多樣性和親緣關(guān)系等方面有一些研究，幫助人們初步了解石斛的相對遺傳關(guān)系，揭示物種的瀕危狀況，有利于資源保護(hù)和可持續(xù)利用。但與擬南芥等模式植物相比仍有不少的差距，以下是筆者從開發(fā)范圍、開發(fā)深度與標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用3個(gè)方面總結(jié)本研究領(lǐng)域應(yīng)繼續(xù)完善以及還未解決的問題：（1）國內(nèi)石斛屬劃分為13個(gè)組，目前已有文獻(xiàn)記載的SSR標(biāo)記研究對象主要集中于石斛組中鐵皮石斛、霍山石斛、粉花石斛等具有藥用價(jià)值的種類，而對于其他組和其他種的研究相對較少或仍處于未知階段，后期應(yīng)對不同組別與種類的石斛屬植物進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)與分析，積累更多的遺傳數(shù)據(jù)與測試技術(shù)，從而更好地應(yīng)用于石斛屬的遺傳多樣性研究。（2）現(xiàn)已開發(fā)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)較少，雖然位點(diǎn)多態(tài)性較高，但獲得的遺傳信息仍然不足以覆蓋石斛的全基因組，以致遺傳分析結(jié)果所反映出的種群遺傳結(jié)構(gòu)信息出現(xiàn)偏差，基于此構(gòu)建的遺傳圖譜分辨率較低，限制了石斛屬植物QTL研究深入，難以發(fā)掘目的性狀關(guān)聯(lián)基因。目前已有少數(shù)高通量數(shù)據(jù)用于石斛屬SSR標(biāo)記開發(fā)，隨著測序技術(shù)的發(fā)展與成本的不斷降低，可以利用最新第三代以納米孔測序?yàn)榇淼膯畏肿訉?shí)時(shí)DNA測序技術(shù)批量開發(fā)更豐富的SSR標(biāo)記，構(gòu)建高密度遺傳圖譜，并發(fā)掘與石斛活性多糖、石斛堿等重要經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)生長性狀的精確定位。（3）石斛屬種內(nèi)變異多，不同種質(zhì)資源在化學(xué)成分和藥理活性上也存在差異，市場上以次充好的現(xiàn)象屢現(xiàn)。傳統(tǒng)石斛種質(zhì)鑒定多為形質(zhì)與生化標(biāo)準(zhǔn)，部分研究已開展石斛種質(zhì)資源的分子指紋圖譜構(gòu)建，但現(xiàn)階段僅2018年霍山石斛鑒定頒布了分子鑒定地方標(biāo)準(zhǔn)，缺少支撐產(chǎn)業(yè)的國家性標(biāo)準(zhǔn)，其他眾多石斛品種的分子檢測標(biāo)準(zhǔn)還處空白，產(chǎn)品質(zhì)量及安全性難以保證，因此，建議廣泛開展石斛品種特異性SSR位點(diǎn)開發(fā)，并由國家相關(guān)部門及早制定國家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，從特異性引物序列、不同制品DNA提取、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測、數(shù)據(jù)采集、判定標(biāo)準(zhǔn)等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行統(tǒng)一管理，使該檢測手段形成行業(yè)規(guī)范。