孫興忠，曹利利，宮鵬濤，董 航，郭衍冰，姚新華，苑淑賢*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春 130062；2. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062

1 前言

華支睪吸蟲病，現(xiàn)又名肝吸蟲病，主要因華支睪吸蟲寄生在人或動(dòng)物肝膽管后，引發(fā)肝膽管病變的一種人畜共患病。該病流行情況比較廣泛，主要在中國(guó)、日本、越南等國(guó)均有發(fā)生，我國(guó)境內(nèi)多數(shù)省都有過(guò)對(duì)該病的報(bào)道[1]。人和動(dòng)物感染該病主要以生食魚、蝦或飲用感染后的水源而患病，患病后初期癥狀不明顯，會(huì)成為長(zhǎng)期蟲體攜帶者，慢慢會(huì)對(duì)肝膽等器官造成一定損傷，最終導(dǎo)致膽管發(fā)炎、肝硬化、肝膽管癌等癥。因此，如何在該病的前期有效地診斷很有必要，華支睪吸蟲病的診斷介紹如下。

2 診斷方法

2.1 病原學(xué)診斷

感染華支睪吸蟲病的動(dòng)物，其蟲體會(huì)進(jìn)入動(dòng)物的體內(nèi)，而后蟲卵和幼蟲會(huì)慢慢隨著動(dòng)物的糞便排出，這樣我們就可以通過(guò)檢查動(dòng)物的糞便來(lái)確定感染華支睪吸蟲情況，并且可確定感染嚴(yán)重程度。檢測(cè)糞便中蟲卵最好的方法主要有醛醚法、改良加藤法、沉淀法、漂浮法，氫氧化鈉消化法等，并通過(guò)顯微鏡觀察，看蟲卵形態(tài)特性最終確診是否感染，這幾種方法是華支睪吸蟲檢測(cè)最直接有效的方法。除糞便檢查外，還有十二指腸引流法可檢測(cè)華支睪吸蟲蟲卵，此方法檢出率將近100%，但實(shí)際操作技術(shù)復(fù)雜，很難實(shí)施[2]。

因華支睪吸蟲蟲卵比較小，鑒別該蟲卵還需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)實(shí)驗(yàn)員才可分辨，而且糞便檢查時(shí)所需要的糞量很少，如動(dòng)物感染較輕，隨糞便排出的蟲卵數(shù)少，這樣在實(shí)際檢測(cè)當(dāng)中，極易造成有蟲卵存在而漏檢。除此之外，該蟲卵與其他吸蟲的蟲卵在大小和形態(tài)方面有相似之處，很容易發(fā)生誤診。傳統(tǒng)的這些病原診斷方法不但對(duì)操作人員技術(shù)要求高，而且操作過(guò)程工作量比較大，極易造成誤診、漏檢等現(xiàn)象，很難滿足大規(guī)模流調(diào)、診斷、防治等工作，實(shí)際工作中存在局限和弊端。

2.2 免疫學(xué)診斷

利用免疫學(xué)診斷華支睪吸蟲病有間接血凝試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)、血清循環(huán)抗原檢測(cè)、皮內(nèi)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及免疫膠體金技術(shù)等。這些方法當(dāng)中，在診斷中用的較多的主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫膠體金技術(shù)。病原學(xué)方法有一定的缺陷，而免疫學(xué)方法是對(duì)其的一個(gè)重要補(bǔ)充。隨著免疫學(xué)診斷的發(fā)展，其抗原敏感性和特異性仍不能達(dá)到很高的水平，現(xiàn)階段臨床上在輔助診斷上應(yīng)用較多，因此在流行病學(xué)調(diào)查和診斷方面是不可缺少的。隨著免疫學(xué)的進(jìn)步和完善，探索特異性強(qiáng)、敏感性好的抗原是該病診斷發(fā)展最直接的途徑，并將成為免疫學(xué)診斷研究的重點(diǎn)[3]。

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA方法的出現(xiàn)大概在70年代之后，經(jīng)過(guò)幾十年的進(jìn)步和完善，現(xiàn)在已成為成熟的免疫診斷技術(shù)，敏感性一般83.1%～100%[2]。該方法優(yōu)點(diǎn)在于所用血量少、操作簡(jiǎn)單，實(shí)際應(yīng)用便捷[4]，但有時(shí)候ELISA方法也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、交叉反應(yīng)，現(xiàn)階段在ELISA的基礎(chǔ)上，又研究出多種改進(jìn)ELISA方法。

2.2.2 間接血凝試驗(yàn)

間接血凝試驗(yàn)（IHA），該方法在一般情況下，主要使用成蟲可溶解的抗原來(lái)作為檢測(cè)用抗原，如將抗原進(jìn)行一定程度純化后可增強(qiáng)準(zhǔn)確性。該方法擁有操作便利、速度較快，并且結(jié)果直接觀察方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，而且感染強(qiáng)弱還可通過(guò)結(jié)果顯現(xiàn)出來(lái)。但該方法多次試驗(yàn)證實(shí)穩(wěn)定性不高，曾與糞檢法比較符合率75%～95%，存在較大的差異，所以使用該方法時(shí)需注意加強(qiáng)重復(fù)。

2.2.3 免疫膠體金技術(shù)

膠體金主要是疏水膠體溶液,并帶有負(fù)電荷。它的作用是吸附并結(jié)合像蛋白質(zhì)這樣的高分子物質(zhì)，最后獲得膠體金蛋白。因?yàn)榻痤w粒擁有高電子密度性質(zhì)，而且標(biāo)記物在固相載體上面，載體上的抗原、抗體發(fā)生反應(yīng)位置的標(biāo)記物匯集密度增加到一定時(shí),我們就會(huì)看見(jiàn)粉紅色的斑點(diǎn)。該方法具有敏感、簡(jiǎn)單以及快速等優(yōu)點(diǎn)，已大規(guī)模進(jìn)行檢測(cè)試劑盒的研發(fā)。

2.3 分子生物學(xué)診斷方法

近幾年，分子生物學(xué)迅猛進(jìn)步，已大量用在多種寄生蟲病診斷之中，對(duì)該病的診斷和應(yīng)用有很多報(bào)道。Traub等利用核糖體的ITS序列建立PCR方法，經(jīng)試驗(yàn)特異性71.0%，敏感性76.7%，并將該技術(shù)第一次應(yīng)用華支睪吸蟲病。鄭培明等[5]應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)感染華支睪吸蟲病的病人，最后證實(shí)該方法可用于該病感染檢測(cè)。雖然分子生物學(xué)技術(shù)在華支睪吸蟲病診斷中特異性和敏感性較高，但在實(shí)際操作中所用時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)環(huán)境要求高以及需專門檢測(cè)設(shè)備，所以在一定程度上限制該方法的普及應(yīng)用。

2.3.1 常規(guī)PCR方法

該方法在華支睪吸蟲病診斷中有著極其重要作用，它具有敏感性高、批量檢測(cè)數(shù)目較大、診斷誤差較小等諸多優(yōu)點(diǎn)。Muller B等利用ITS2序列設(shè)計(jì)引物，然后建立常規(guī)PCR方法，并利用該方法從感染的淡水魚、淡水螺中檢測(cè)到了華支睪吸蟲基因，檢測(cè)可達(dá)10-4ng DNA ,特異性較強(qiáng)；而后利用PCR技術(shù)成功在糞便中檢出后睪科吸蟲卵，敏感性和特異性很好，該方法可用在患病動(dòng)物糞便檢測(cè)?，F(xiàn)階段，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，該方法在臨床中應(yīng)用較廣泛,大多應(yīng)用在流行病學(xué)調(diào)查、疫病治療期間的監(jiān)測(cè)以及特異性診斷等方面發(fā)揮不可替代的作用。

2.3.2 套氏PCR方法

該方法是一種特殊的PCR方法，在操作中主要是利用2對(duì)引物，來(lái)擴(kuò)增DNA，其中的兩個(gè)引物分別叫外引物和內(nèi)引物，外引物含有內(nèi)引物的一些片段，通過(guò)2次PCR擴(kuò)增2次識(shí)別靶基因，從而增加了檢測(cè)敏感性和特異性。陳瑩等[6]先設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)華支睪吸蟲囊蚴的DNA擴(kuò)增，將200～1 000 bp擴(kuò)增片段測(cè)序后，進(jìn)行同源性對(duì)比，而后根據(jù)結(jié)果設(shè)計(jì)2對(duì)引物，同時(shí)進(jìn)行一次法PCR和套氏PCR，最終結(jié)果顯示套氏PCR要比一次法PCR更高的敏感性，檢測(cè)濃度達(dá)到10～5 ng，而且與衛(wèi)氏并殖吸蟲、扇棘單睪吸蟲、曼氏血吸蟲和麝貓后睪吸蟲沒(méi)有交叉反應(yīng)。

2.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR方法

相對(duì)于常規(guī)PCR方法，實(shí)時(shí)定量PCR方法不僅實(shí)現(xiàn)定性而且還可以定量，既可實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增又可對(duì)核酸進(jìn)行定量。精準(zhǔn)測(cè)出樣品中DNA或RNA的準(zhǔn)確基因數(shù)目[6]。Cai等根據(jù)華支睪吸蟲ITS1核酸片段合成157 bp大小的引物，構(gòu)建實(shí)時(shí)定量PCR方法。KIM等利用華支睪吸蟲ITS2片段，使用該方式檢測(cè)170份糞便，結(jié)果顯示特異性好，只有與麝貓后睪吸蟲有交叉出現(xiàn)。蔣智華等[7]利用線粒體中的色素C相關(guān)基因設(shè)計(jì)因引物，最終成功建立雙重PCR方法，可用于鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲。該方法對(duì)華支睪吸蟲的檢測(cè)逐漸完善，是分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)展的飛躍。

3 結(jié)語(yǔ)

據(jù)了解，現(xiàn)階段我國(guó)已大部分地區(qū)動(dòng)物有華支睪吸蟲病的流行，所以建立有效、快速的診斷方法迫在眉睫。而且在該病現(xiàn)有的診斷方法中有很多缺陷，比如假陽(yáng)性、假陰性以及檢測(cè)過(guò)程中交叉反應(yīng)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這些問(wèn)題都將限制檢測(cè)方法的發(fā)展，所以尋求敏感特異的方法，和制備一些穩(wěn)定可靠的抗原也是解決該問(wèn)題的重要環(huán)節(jié)。

在現(xiàn)有的各種方法中，每一種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和不足，這就要求我們?cè)谑褂脮r(shí)取其優(yōu)點(diǎn)克服不足。糞便法可對(duì)該病進(jìn)行確診，但在實(shí)際檢測(cè)中誤檢、漏檢較高以及工作量相對(duì)較大。免疫學(xué)診斷方法具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，還有特異性和敏感性需要獲得新的華支睪吸蟲特異抗原。分子生物學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展大大提升檢測(cè)的敏感性，不但可定性還可定量，這將會(huì)成為將來(lái)該病診斷方法之一，也將為今后華支睪吸蟲病診斷研究起到促進(jìn)作用。