陳垚鑫， 鄧芝花， 錢進(jìn)先

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension， PAH)是由多種已知或未知原因致肺血管重塑而引起的肺動(dòng)脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮完整性的喪失和細(xì)胞外基質(zhì)的積累，包括膠原蛋白沉積、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和肥大，導(dǎo)致動(dòng)脈中層肥厚、向心或偏心性內(nèi)膜增生和血管肌肉化，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈進(jìn)行性閉塞、肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高，甚至發(fā)展為右心室功能障礙[1-2]。目前臨床治療藥物(包括前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶5抑制劑等)主要是通過選擇性舒張肺動(dòng)脈，降低肺動(dòng)脈壓力，從而改善其臨床癥狀，但是在改善肺血管重塑方面的作用有限，PAH患者一年病死率仍高達(dá)15%。一些研究[3]已經(jīng)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一種不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠有效地降低PAH中的肺動(dòng)脈壓力，改善右心功能。然而，MSCs不穩(wěn)定且定向分化能力較差，因此推測(cè)其主要通過旁分泌方式分泌生物因子發(fā)揮治療作用。外泌體則是MSCs與靶細(xì)胞間通訊交流的一種介質(zhì)。本文就MSCs源性外泌體的生物學(xué)特征，以及其在PAH中的作用及其潛在作用機(jī)制作一綜述。

1 MSCs與外泌體

1.1MSCs的作用 MSCs是一種能不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細(xì)胞。一方面，其干細(xì)胞的特性賦予其多種生物功能，如分化為各譜系細(xì)胞進(jìn)而修復(fù)組織損傷、促進(jìn)組織再生，調(diào)節(jié)炎癥及免疫系統(tǒng)等[1]；另一方面，MSCs是最容易獲取的干細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪組織及臍帶血等多種途徑提取，因此，MSCs在各種疾病研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[4-5]。然而，MSCs不穩(wěn)定，直接使用干細(xì)胞有潛在的免疫排斥或染色體變異及致瘤等可能[6]，且其定向至受損組織發(fā)揮作用的方式容易受多種環(huán)境的因素影響，作用效率不高，有很大的局限性。經(jīng)過大量研究[5]證實(shí)，MSCs培養(yǎng)上清或其成分可以介導(dǎo)MSCs的一些生物功能，它主要以旁分泌方式分泌生物因子去發(fā)揮作用的。

1.2外泌體的生物學(xué)特征

外泌體(Exosome， Exo)在20世紀(jì)80年代首次被發(fā)現(xiàn)，被定義為由脂質(zhì)雙分子層組成的具有“碟狀”形態(tài)的微小小泡，屬于細(xì)胞外囊泡的一種。細(xì)胞外囊泡是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，根據(jù)囊泡的大小和形成方式，分為外泌體(30～150 nm)及微囊泡(50～1000 nm)、微粒或凋亡小體(50～5000 nm)[7]。它們功能相似，在形成過程中攜帶母體細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等分子，在細(xì)胞間的信息交流過程中起到了重要作用。不同的是微囊泡等是細(xì)胞質(zhì)膜受刺激后直接脫落而成，而外泌體的形成是細(xì)胞膜內(nèi)部出芽，逐漸形成多囊泡(MVB)和腔內(nèi)囊泡(ILV)后通過胞吐作用釋放的。外泌體幾乎可以由所有細(xì)胞類型釋放，并可存在于血液、尿液和母乳等體液中[5,7]。

外泌體最初被認(rèn)為是清除機(jī)體代謝廢物的“垃圾車”，通過不斷的探索，目前更多觀點(diǎn)[7]認(rèn)為，其是細(xì)胞間信息交流的關(guān)鍵，在此過程中發(fā)揮著不可替代的作用。主要有以下幾方面的原因：第一，外泌體形成方式使其具有低免疫原性及可運(yùn)輸性等，這些特性使得外泌體成為良好的細(xì)胞間信息交流的介質(zhì)；第二，外泌體作用方式廣泛，可以通過受體配體相結(jié)合，以及與受體細(xì)胞胞膜直接結(jié)合或相互融合的方式，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞，從而起到傳遞生物信息的作用[5, 7-8]；第三，不同來源的外泌體可以攜帶其來源的生物信息分子參與不同的生理或病理過程，還可以直接影響受體細(xì)胞的基因表達(dá)及細(xì)胞表型，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，發(fā)揮相應(yīng)作用[7, 9]。

2 MSCs、外泌體對(duì)PAH的治療作用及機(jī)制

MSCs功能機(jī)制及外泌體的應(yīng)用均是當(dāng)前各種疾病的研究熱點(diǎn)。MSCs來源的外泌體(MSCs-Exo)具有MSCs相似的生物功能，它們?cè)诟鞣N疾病模型中被廣泛研究。Jason等[1]通過建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型證明，胞外囊泡發(fā)揮治療作用主要是通過外泌體實(shí)現(xiàn)的，靜脈注射MSCs-Exo可以抑制低氧誘導(dǎo)的PAH的血管重建，但是給予去除外泌體的MSCs培養(yǎng)上清和成纖維細(xì)胞來源的外泌體并沒有此作用[10]。許多研究[11]表明，MSCs-Exo對(duì)改善PAH是有作用的，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：改善心肺血流動(dòng)力學(xué)、改善血管重塑、減緩右心室肥厚及右心衰竭的程度等。這幾個(gè)方面的作用并不是獨(dú)立體現(xiàn)的，這其中的關(guān)鍵點(diǎn)是改善肺血管的重塑，緩解肺動(dòng)脈壓力的升高，從而改善右心病理改變及相應(yīng)的臨床癥狀。

2.1MSCs-Exo抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的異常增殖

PASMC的異常過度增殖是PAH肺血管重建病理過程中的關(guān)鍵，已有研究表明，MSCs-Exo可通過抑制該過程發(fā)揮治療作用。

一方面，外泌體可作為細(xì)胞間物質(zhì)傳遞載體直接影響受體細(xì)胞基因表達(dá)，因此，MSCs-Exo調(diào)控PASMC增殖過程中的基因表達(dá)是常見的作用機(jī)制。Zhang等[11]研究表明，人臍帶血MSCs來源的外泌體可通過Wnt非典型信號(hào)通路下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達(dá)，干擾細(xì)胞增殖周期，從而抑制PASMC的過度增殖。另一方面，有研究[12-13]表明，PASMC在受到環(huán)境等刺激時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，這可能是導(dǎo)致肺血管重塑的原因之一。相應(yīng)的研究[11]表明，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)信號(hào)通路可能誘發(fā)PASMC的增殖表型，給予MSCs-Exo可觀察到PASMC的增殖受到抑制，同樣也觀察到了GSK3β的表達(dá)下降。因此，MSCs-Exo可以通過調(diào)節(jié)PASMC表型轉(zhuǎn)換，從而在改善血管重建方面發(fā)揮部分作用。

2.2MSCs-Exo抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)凋亡、遷移

越來越多的證據(jù)表明，PAEC的功能失調(diào)是PAH發(fā)生、發(fā)展的又一重要事件，血管內(nèi)皮的完整性是血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的關(guān)鍵，在缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等刺激下，PAEC損傷凋亡的影響是多方面的(包括肺血管張力、炎癥、凝血、代謝和重構(gòu))。同時(shí)，PAEC釋放的旁分泌因子也可能調(diào)節(jié)PASMC的存活、增殖及其功能表型，導(dǎo)致PASMC不受控制的增殖，并最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)[14]，還有研究[15]表明，PAEC釋放的外泌體可作為載體將翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein， TCTP)從內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到PASMC，從而促進(jìn)PASMC的增殖和凋亡抵抗。另外，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞逐漸將其內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，在此過程中，細(xì)胞間黏附相關(guān)蛋白及表型丟失，并且獲得遷移能力，向組織內(nèi)部遷移導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚，血管閉塞[16]。

研究[11]表明，MSCs-exo對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAEC損傷具有保護(hù)作用：一方面，MSCs-exo對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAEC凋亡和EndoMT具有抑制作用，細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因上調(diào)，促凋亡基因受到抑制，抑制PAEC的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率；另一方面，MSCs-exo提高了PAEC血管生成能力、促進(jìn)細(xì)胞黏附和收縮，均有利于肺動(dòng)脈血管重塑的改善。

2.3MSCs-exo調(diào)控細(xì)胞的炎癥激活途徑

炎癥反應(yīng)的激活可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、PASWC的增殖及免疫炎性細(xì)胞的聚集，引起肺血管重構(gòu)和PAH的形成。多項(xiàng)研究表明，外泌體可以通過抑制炎癥激活途徑，減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解肺血管重塑。

在野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型中，MSCs源性外泌體使抗炎、抗增殖的miRNA表達(dá)明顯增加(如miR-34a、miR-122、miR-124和miR-127)，從而降低了右心肥厚指數(shù)[1]。研究[10]表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧性PAH小鼠中，它與肺血管細(xì)胞的炎性水平及高增殖表型等相關(guān)。MSCs-exo可通過抑制STAT3信號(hào)通路，降低了白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(chemoattractant protein-1, MCP-1)等促炎性因子水平，抑制炎癥及缺氧相關(guān)信號(hào)通路的激活，從而改善PAH。James等[4]從免疫調(diào)節(jié)角度證明了血管重塑的改善與減少巨噬細(xì)胞招募到肺組織、減少巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、巨噬細(xì)胞的經(jīng)典炎癥激活途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱丝寡准せ钔緩接嘘P(guān)。這些研究[2]表明，MSCs源性外泌體對(duì)PAH炎癥激活途徑具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，可能是治療PAH的一種有效的新療法。

2.4MSCs-Exo調(diào)控細(xì)胞的代謝途徑

代謝紊亂是PAH的重要特征之一，PAH能使右心室及肺血管的病理改變過程中所涉及很多代謝相關(guān)生物分子水平改變[17-18]。Weiling等[19]總結(jié)了與PAH病理變化相關(guān)的7種主要代謝途徑(包括葡萄糖和脂肪酸氧化、谷氨酰胺分解、精氨酸代謝、一碳代謝、氧化還原反應(yīng)、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈。同時(shí)也表明，線粒體是生物合成途徑和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中介導(dǎo)代謝途徑的主要細(xì)胞器。缺氧可引起線粒體功能障礙，一方面線粒體功能障礙后繼發(fā)胰島素抵抗和葡萄糖不耐受，具體表現(xiàn)為糖酵解的增加、葡萄糖氧化磷酸化的減少，為PAH過程中異常增殖的細(xì)胞持續(xù)提供能量和生物分子原料，在PAH發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的作用，這種代謝方式被稱作有氧糖酵解，亦稱作“華寶效應(yīng)”[20-21]。另一方面，線粒體參與的穩(wěn)態(tài)氧感應(yīng)系統(tǒng)(homeostatic oxygensensing system, HOSS)是體內(nèi)感知生理范圍內(nèi)氣道氧水平和動(dòng)脈氧分壓微小變化的特殊組織構(gòu)成的，當(dāng)環(huán)境氧水平或體內(nèi)氧分壓水平有變化時(shí)，線粒體內(nèi)的傳感器改變活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，ROS被線粒體超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)局部快速轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫從線粒體擴(kuò)散到細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)離子通道和酶，激活缺氧誘導(dǎo)因子1α，從而擾亂線粒體代謝和動(dòng)力學(xué)，加速細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[22]。研究表明，MSCs-Exo可以改善PAH缺氧暴露后的葡萄糖代謝轉(zhuǎn)變和線粒體功能。MSCs-Exo可以增加丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)和谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1)的表達(dá)，GLUD1將谷氨酸轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)代謝物α-酮戊二酸、PDH將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，均將糖酵解連接到TCA循環(huán)中，提高氧化磷酸化水平，改善線粒體功能，從而降低了細(xì)胞凋亡和壞死[23]。

PAH的病理變化主要有肺血管的重塑、炎性途徑的激活及血管的閉塞等，表現(xiàn)為肺血管細(xì)胞的過度增殖和凋亡、膠原蛋白的沉積等[2, 10]。目前對(duì)PAH的治療方法有限，大量研究已表明，MSCs來源的外泌體可以預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)PAH的進(jìn)展，從而為PAH治療提供了一種新的選擇。但是，MSCs源性外泌體在PAH治療中仍存在一些不足，一方面，MSCs來源的外泌體包含的物質(zhì)種類頗多(包括蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子)，參與調(diào)節(jié)PAH的關(guān)鍵性分子及通路機(jī)制尚不明確；另一方面，適用于臨床治療的靶點(diǎn)及療效評(píng)估的標(biāo)志物尚不清楚。因此，這也是未來需要進(jìn)一步探索的方向。