在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞間通訊是維持細(xì)胞功能和組織穩(wěn)態(tài)所必需的。這種細(xì)胞間的溝通可通過細(xì)胞間的直接聯(lián)系來實(shí)現(xiàn)，也可通過分泌介質(zhì)來傳遞。其中細(xì)胞釋放各種類型的囊泡，如外泌體、核內(nèi)體、微囊泡等可攜帶DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在細(xì)胞通訊中起到關(guān)鍵作用，外泌體為近年生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)

。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的直徑約30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/mL的納米級(jí)球形脂質(zhì)雙分子層囊泡

。雖然外泌體這一名詞已得到普遍使用，但根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（International Society for Extracellular Vesi?cles，ISEV）2018 年指南，由于外泌體分離存在困難，因此將普遍提取的外泌體學(xué)術(shù)詞匯定義為“細(xì)胞外小泡（small extracellular vesicles，sEVs）”

。目前外泌體提取已存在的技術(shù)主要是基于體積和密度差異的原理，這些分離技術(shù)大多不能完全分離及純化出外泌體。

不同細(xì)胞來源的外泌體其內(nèi)容物和功能具有特異性，研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源外泌體可根據(jù)其性能分別用于疾病的診斷、藥物的傳輸以及免疫治療和再生藥物等。雖然外泌體的商業(yè)價(jià)值已得到廣泛的關(guān)注，但其臨床研究并不樂觀，主要原因在于：①目前尚未研發(fā)出外泌體大規(guī)模生產(chǎn)純化的技術(shù)

；②目前國(guó)際上尚未制定出外泌體商品化臨床生產(chǎn)準(zhǔn)則

。因此，本文將綜合分析已存在的外泌體分離技術(shù)，比較不同分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)目前提出的外泌體提取規(guī)范原則進(jìn)行論述，并闡明不同細(xì)胞來源外泌體的功能及作用，闡述牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的應(yīng)用前景，為未來外泌體的提取及使用提供參考和建議。

1 外泌體的形成途徑

所有細(xì)胞均可在生理或病理情況下釋放外泌體，最開始外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞廢棄物，后來通過研究逐漸發(fā)現(xiàn)外泌體中含有生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、miRNAs 等，在機(jī)體生理和病理過程中扮演著重要角色。它的形成過程主要是由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成最初的核內(nèi)體，胞內(nèi)生物活性物質(zhì)在早期核內(nèi)體中積累，并在內(nèi)吞分選機(jī)制下分選及運(yùn)輸所需的復(fù)合物和其他相關(guān)蛋白質(zhì)形成晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體再次通過向內(nèi)出芽形成多囊泡，最后多囊泡與細(xì)胞膜融合釋放至胞外形成外泌體

。外泌體的產(chǎn)生機(jī)制主要通過以下途徑：①Rab 蛋白（小G 蛋白）通過核內(nèi)體和質(zhì)膜調(diào)控外泌體的生物發(fā)生；Rab 蛋白決定細(xì)胞器膜的特性，招募機(jī)械效應(yīng)因子，并介導(dǎo)細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)。Os?trowski 等

發(fā)現(xiàn)Rab27a、Rab27b 參與了多囊泡的生物發(fā)生和定位，其中Rab27a 通過調(diào)控質(zhì)膜PIP2（水通道蛋白）動(dòng)態(tài)來組裝質(zhì)膜微域，參與質(zhì)膜囊泡出芽。Rab35 可定位于質(zhì)膜，調(diào)節(jié)質(zhì)膜PIP2 水平，參與外泌體的發(fā)生。Rab11 則是通過鈣誘導(dǎo)與多囊泡融合來影響外泌體的生物發(fā)生。②Ral/Arf6/PLD2/syntenin/Alix 軸（小GTP 酶/二磷酸腺苷核糖基化因子6/磷脂酶D2/胞內(nèi)銜接蛋白/凋亡連接基因?2?相互作用蛋白X）調(diào)控外泌體的生物發(fā)生；Ral 蛋白可調(diào)控二磷酸腺苷核糖基化因子6（ADP?ribosylation factor6，Arf6）和磷脂酶D2（phos?pholipase D2，PLD2）的分泌，Arf6 和PLD2 可使外泌體分泌syntenin 和Alix，幫助外泌體的膜形成

。③內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting com?plex required for transport，ESCRT）途徑形成外泌體；ESCRT 可參與多囊泡的形成、核包裹、質(zhì)膜修復(fù)，促進(jìn)囊泡移動(dòng)以及出芽。ESCRT 主要是催化膜分裂完成這一進(jìn)程。因此，ESCRT 被大部分學(xué)者認(rèn)為是外泌體的依賴途徑，但是這一觀點(diǎn)尚缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持。該途徑始于合成素?合成聚糖的相互作用，早期核內(nèi)體在內(nèi)吞作用的控制下分選復(fù)合物以及相關(guān)蛋白，通過Arf6 與細(xì)胞程序性死亡蛋白1 配體2（programmed cell death1 ligand 2，PDL2）作用進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)形成晚期核內(nèi)體，進(jìn)而向腔內(nèi)出芽形成腔內(nèi)囊泡，多個(gè)腔內(nèi)囊泡形成了多囊泡內(nèi)體，這一過程中胞內(nèi)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子相關(guān)酪氨酸激酶（hepatocyte growth factor associated tyro?sine kinase，Hrs）可與腫瘤易感基因101（tumor sus?ceptibility gene 101，TSG101）作用降低胞內(nèi)囊泡的數(shù)量，而泛素樣蛋白15 可抑制TSG101 的泛素化，增加外泌體的釋放

。④自噬參與外泌體的分泌；研究發(fā)現(xiàn)在癌癥細(xì)胞中敲除自噬相關(guān)蛋白5（au?tophagy related gene 5，Atg5），外泌體的產(chǎn)生減少；相反，當(dāng)CRISPR/cas9（可有效編輯有機(jī)體內(nèi)部分基因的CRISPR 基因組）介導(dǎo)敲除的Atg5 神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以增加外泌體的釋放

。

隨著醫(yī)保改革的逐漸深入，醫(yī)院的醫(yī)?；颊弑壤饾u增大，醫(yī)院對(duì)醫(yī)保費(fèi)用的合理控制直接關(guān)系到醫(yī)院未來的發(fā)展，同時(shí)也影響廣大參?；颊叩臋?quán)益。國(guó)務(wù)院辦公廳發(fā)布的《城市公立醫(yī)院綜合改革試點(diǎn)的指導(dǎo)意見》中明確指出公立醫(yī)院要“降低藥品和醫(yī)用耗材費(fèi)用……嚴(yán)格控制醫(yī)藥費(fèi)用的不合理增長(zhǎng)”。在當(dāng)前的醫(yī)改環(huán)境下，醫(yī)院應(yīng)在提高醫(yī)療服務(wù)技術(shù)和質(zhì)量的同時(shí)，加強(qiáng)精細(xì)化管理，提高工作效率，節(jié)約運(yùn)營(yíng)成本，合理控制藥品和耗材費(fèi)用。

2017年，我國(guó)甘薯總產(chǎn)量7 057.1萬t,按照55%的加工比例和20%的產(chǎn)品原料比,當(dāng)年我國(guó)甘薯加工品產(chǎn)量約為780萬t．戴起偉等[5]估算結(jié)果顯示,當(dāng)前我國(guó)國(guó)內(nèi)甘薯加工產(chǎn)品消費(fèi)量約在500萬t以上,因此，粗略估算,我國(guó)甘薯加工品的年出口水平應(yīng)在200～280萬t之間．

2 外泌體分離技術(shù)

為使標(biāo)準(zhǔn)化胞外囊泡提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床研究，2018 年11 月國(guó)際胞外囊泡協(xié)會(huì)在中國(guó)廣州發(fā)起了以胞外囊泡為基礎(chǔ)的臨床研討會(huì)。眾多專家學(xué)者就4 個(gè)關(guān)鍵主題進(jìn)行了討論：①胞外囊泡的標(biāo)準(zhǔn)化分離及提取技術(shù)；②胞外囊泡組學(xué)分析及生物標(biāo)記物的探索；③胞外囊泡生物標(biāo)記物在臨床診斷的應(yīng)用；④胞外囊泡在人類疾病中的治療。就“胞外囊泡的標(biāo)準(zhǔn)化分離及提取技術(shù)”這一專題，學(xué)者們討論了最前沿的外泌體快速分離技術(shù)如目前發(fā)展較快的芯片技術(shù)，另外多種分離技術(shù)結(jié)合的方式也可精確有效地提取外泌體。目前沒有單一的方法可以用于所有樣本類型和應(yīng)用的分析。對(duì)于不同樣本中外泌體的提取，參會(huì)學(xué)者們認(rèn)為需要考慮但不限于以下因素：樣品的來源、胞外囊泡的亞群、用于下游的分析；對(duì)于外泌體純度的考量，定量方法的比值可以提高外泌體純度測(cè)定，可作為外泌體的純度指標(biāo)，比如：蛋白質(zhì)/顆粒比、蛋白質(zhì)/脂質(zhì)比、RNA/顆粒比

。因此，雖然外泌體的提取技術(shù)趨于規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，外泌體采集與分離標(biāo)準(zhǔn)的建立、鑒定標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一、產(chǎn)品制備過程標(biāo)準(zhǔn)化仍是未來需進(jìn)一步明確和解決的問題。

2.1 基于密度的分離方法—差速離心技術(shù)、等密度梯度離心技術(shù)

2.1.2 等密度梯度離心技術(shù) 等密度梯度離心技術(shù)是根據(jù)細(xì)胞外成分的密度不同分離出外泌體，不同密度的蔗糖或碘克沙醇為密度梯度管中的介質(zhì)成分，其使用率達(dá)11.6%

。在離心力的作用下，樣品中的外泌體、凋亡小體以及蛋白聚合物會(huì)固定在相同密度介質(zhì)中從而分離外泌體，外泌體一般聚集在1.10～1.18 g/mL 密度層

。雖然這種方法可以分離不同密度的胞外成分以及外泌體亞群，但對(duì)于不同大小、相同密度的胞外物質(zhì)如微囊泡分離存在困難，動(dòng)區(qū)密度梯度離心（moving?zone density?gradient centrifugation）是目前改良的一種分離技術(shù)，可在密度和大小二維方向上更進(jìn)一步提純外泌體。雖然該方法提取的外泌體純度高，但其容納的樣本有限，設(shè)備貴，且需要高資質(zhì)的技術(shù)人員

。

2.1.1 差速離心技術(shù) 差速離心技術(shù)是目前分離外泌體使用最多的提取方法，其使用率高達(dá)45.7%

。差速離心技術(shù)的原理是根據(jù)樣品中胞外囊泡密度和尺寸大小的不同，在不同離心力作用下分離出外泌體。差速離心技術(shù)含量低，不需要繁雜的預(yù)處理，這一提取技術(shù)可廣泛提取細(xì)胞上清、血清、唾液、尿液以及腦脊液等來源的外泌體樣本。然而，差速離心技術(shù)可使具有相同質(zhì)量、密度及大小的外泌體、微囊泡以及蛋白、脂質(zhì)體等沉積在一起，難以獲取完全純化的外泌體。此外，由于差速離心技術(shù)需使用大的離心力，對(duì)外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)會(huì)造成一定程度的損傷

。

2.2 基于尺寸的分離方法—尺寸排阻色譜技術(shù)和超濾技術(shù)

2.2.1 尺寸排阻色譜技術(shù) 尺寸排阻色譜（size ex?clusion chromatography，SEC）技術(shù)是通過特定材料的孔隙微粒分離含有不同分子量的溶液，現(xiàn)使用的固相多孔隙材料主要有高分子右旋糖苷、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等

。尺寸排阻色譜技術(shù)最大的特點(diǎn)是可以保護(hù)外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和完整性不受破壞，其次該方法操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間，調(diào)整孔隙大小可以得到不同的胞外囊泡亞群

。近期iZON 公司研發(fā)出基于尺寸排阻色譜技術(shù)的自動(dòng)外泌體分離系統(tǒng)，可對(duì)外泌體進(jìn)行高效、自動(dòng)化提取

。尺寸排阻色譜技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，如分離的外泌體中含有與其徑粒相似的蛋白質(zhì)聚合物和脂質(zhì)體。在2013 年國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)上，學(xué)者提議將超濾技術(shù)和尺寸排阻色譜技術(shù)結(jié)合，可提高外泌體的提取純度

。

4.1.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體修復(fù)損傷組織間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層的多種組織，包括骨髓、肝臟、脾臟、外周血、脂肪、胚胎和臍帶血，具有自我更新和分化的能力。近年來間充質(zhì)干細(xì)胞多用于組織再生、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)的研究，大量研究發(fā)現(xiàn)使用間充質(zhì)干細(xì)胞研究時(shí)，只有小部分細(xì)胞可作用于損傷部位，因此，“細(xì)胞代替治療”應(yīng)運(yùn)而生，其中，間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌外泌體是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)

。Haga 等

將間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體作用于由D?半乳甘糖（D? Galactose）/腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）誘導(dǎo)的致死性極強(qiáng)的肝損傷小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其中含有短非編碼RNA Y?RNA?1，可緩解肝臟損傷，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，激活抗凋亡通路。Zhang 等

研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理心臟干細(xì)胞來源外泌體，將其移植入心肌梗死的大鼠中，可發(fā)現(xiàn)其可降低心臟纖維化，增加毛細(xì)血管密度，恢復(fù)心臟的功能。Xiong 等

研究表明，脂肪干細(xì)胞來源外泌體中含有細(xì)胞外煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl trans?ferasee，NAMPT）可延緩衰老，這種物質(zhì)可以內(nèi)化入細(xì)胞中，從而增加NAD

的合成，當(dāng)從年輕的小鼠中提取富含eNAMPT 的胞外囊泡，并作用于年老小鼠中，發(fā)現(xiàn)可以衰老減緩，并增加了年老小鼠的生命周期。

2.3 基于聚合物共沉淀的分離方法—聚合物共沉淀試劑盒技術(shù)

聚合物共沉淀技術(shù)的原理是親水性聚合物與樣品中外泌體親水鍵相互作用，在外泌體周圍形成疏水微環(huán)境，從而形成沉淀提取出外泌體?，F(xiàn)常用的外泌體試劑盒中使用的親水性聚合物大多是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）

。聚合物共沉淀技術(shù)簡(jiǎn)單易行，可用于大規(guī)模提取外泌體以及疾病的快速診斷

。然而，該技術(shù)使用的親水性聚合物不僅可以使外泌體發(fā)生沉淀，還可使親水性物質(zhì)如核酸、脂蛋白或者一些病毒的沉積。Patel 等

研究發(fā)現(xiàn)，相比于其它方法提取的外泌體，通過聚合物共沉淀技術(shù)提取的外泌體更具有細(xì)胞毒性。目前，聚合物共沉淀技術(shù)使用了更具有疏水性的PEG 聚合物和更具有親水性的右旋糖苷聚合物形成雙向系統(tǒng)（aqueous two?phase systems，ATPSs），對(duì)外泌體及其它分子進(jìn)行雙向分離，從而在一定程度上改善外泌體污染的問題

。

2.4 基于免疫親和的分離方法—磁珠技術(shù)、色譜固相分離技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附分離技術(shù)

外泌體中含有豐富的特異性膜蛋白如四次跨膜蛋白CD9、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell ad?hesion molecule，EPCAM）、四次跨膜蛋白63（CD63）、小G 蛋白（Rab5）、四次跨膜蛋白81（CD81）、凋亡連接基因?2?相互作用蛋白X（apoptosis linked gene 2 interacting protein X，ALIX）、磷酯結(jié)合蛋白（An?nexin）等

。免疫親和技術(shù)的原理則是通過識(shí)別外泌體的特異性蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的分離和富集。根據(jù)抗體底物載體的不同，免疫親和分離技術(shù)可分為磁珠免疫分離、色譜固相分離、酶聯(lián)免疫吸附分離等。在磁珠免疫分離法中，磁珠負(fù)載鏈霉親和素，對(duì)生物素化的抗體如CD63、CD9 和CD81 具有捕獲能力。雖然免疫親和技術(shù)可提取高純度的外泌體，但該技術(shù)緩沖液中的pH 和鹽濃度會(huì)影響外泌體的活性。此外，與抗體結(jié)合后的外泌體只適用于疾病的診斷，并不適用功能性研究

。因此，有學(xué)者提出適配體篩選技術(shù)，適配體是具有抗體功能的小DNA 或RNA，可識(shí)別特異性蛋白質(zhì)，從而與外泌體結(jié)合，進(jìn)行生物樣品中外泌體的分離，再通過改變適配體的三維結(jié)構(gòu)，可對(duì)分離的外泌體進(jìn)行純化，保證外泌體的完整性

。

2.5 基于微流控技術(shù)的分離方法—基于免疫親和的微流體技術(shù)、基于尺寸的微流體技術(shù)、無接觸式微流體技術(shù)

微流控是近年發(fā)展起來的以信號(hào)探測(cè)為基礎(chǔ)的外泌體提取技術(shù)，可快速對(duì)外泌體進(jìn)行分離，還可以通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外泌體，對(duì)早期未侵襲性疾病作出診斷。基于免疫親和的微流體技術(shù)與免疫親和技術(shù)相似，其在微流體芯片裝置中裝有特異性識(shí)別抗體，免疫親和微流技術(shù)與免疫親和技術(shù)一樣只能獲取外泌的特異性子集，且價(jià)格昂貴，難以維持外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)。

毛主席1936年在保安對(duì)斯諾說：“這是我們唯一的外債，是紅軍拿了藏民的糧食而欠的債，有一天我們必須向藏民償還我們不得不從他們那里拿走的給養(yǎng)?！雹堋都t星照耀中國(guó)》159頁(yè)和《長(zhǎng)征——前所未有的故事》308頁(yè)。鄧小平同志在1952年7月21日西南軍政委員會(huì)第一次全體會(huì)議上說：“紅軍北上，在那里（川西北兄弟民族地區(qū)）是把他們（當(dāng)?shù)乩习傩眨└憧嗔?，這在當(dāng)時(shí)是為保存紅軍，沒有辦法，把他們的糧食吃光了，他們吃了很大的虧，要在具體利益上向他們賠償，真正要從經(jīng)濟(jì)上幫助他們得到利益。”⑤《血對(duì)西藏說》第31頁(yè)——32頁(yè)。

另外，外泌體的臨床轉(zhuǎn)化也需其在同種異體環(huán)境中具有可重復(fù)性、可拓展性、穩(wěn)定性和良好的臨床監(jiān)控性能。Melo 等

通過免疫親和分離技術(shù)從胰腺癌患者的血清中提取外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體可高表達(dá)蛋白多糖和磷脂酰肌醇聚糖1（glypican1，GPC1），GPC1 陽(yáng)性可區(qū)分胰腺癌患者及正?；颊摺Ｈ欢?，Lai 等

學(xué)者則通過色譜固相分離技術(shù)提取外泌體，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者的循環(huán)外泌體中，其中微小RNA miR?10b、miR?21、miR?30c 和miR?181a 的高表達(dá)以及miR?let7a 的低表達(dá)更具有診斷價(jià)值。這兩份科學(xué)研究的不同主要在于外泌體提取方式的差異。因此對(duì)于同一疾病統(tǒng)一的外泌體提取純化標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。

基于尺寸的微流體技術(shù)結(jié)合了尺寸排阻色譜技術(shù)及免疫親和技術(shù)的原理，其裝置由多孔硅材料制成的納米線組成，可阻止細(xì)胞碎片和凋亡小體，同時(shí)裝置中存在特異性的抗體，可有效分離40～100 nm 的外泌體

。無接觸式微流體包含彈性升力

、超聲

及雙向電泳

三種分離方式。彈性升力利用粘彈性介質(zhì)流動(dòng)所產(chǎn)生的升力可操控不同大小粒子的原理來分離腫瘤細(xì)胞、血細(xì)胞、細(xì)菌、飛沫或微球。2017 年這一技術(shù)用于分離外泌體，其外泌體回收率超過80%，純度超過90%

。超聲微流體技術(shù)是利用超聲波對(duì)不同粒子的輻射力分離外泌體，能夠以無標(biāo)記和無接觸的方式從全血中直接分離外泌體，血細(xì)胞去除率超過99.999%

。雙向電泳技術(shù)是一種比較簡(jiǎn)單的微流體技術(shù)，微通道的電泳可驅(qū)動(dòng)樣品中的外泌體通過微流體膜裝置，并過濾其它細(xì)胞外囊泡，然而這種技術(shù)還需深入地探索其效率和可靠性，以及提取出的外泌體生物學(xué)性能

。

3 外泌體提取技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)展

縱觀目前已存在的外泌體提取技術(shù)，主要是基于體積和密度差異的原理來獲取純度較高的外泌體，這一技術(shù)主要體現(xiàn)在臨床前基礎(chǔ)研究中。外泌體的臨床轉(zhuǎn)化勢(shì)必需要實(shí)現(xiàn)從科學(xué)實(shí)驗(yàn)到商業(yè)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)主要需從細(xì)胞培養(yǎng)、外泌體提取和外泌體純化三個(gè)方面進(jìn)行思考和研究。攪拌式生物反應(yīng)器技術(shù)、灌注培養(yǎng)技術(shù)和中空纖維灌注生物反應(yīng)器技術(shù)可實(shí)現(xiàn)外泌體的大批量生產(chǎn)；合適的培養(yǎng)條件如生長(zhǎng)因子、氧氣濃度或其他刺激物影響的研究可探索出高產(chǎn)外泌體的方法。目前，流場(chǎng)流分離和多角度動(dòng)態(tài)光散射是外泌體商業(yè)化生產(chǎn)和純化常用的方法，可精確地測(cè)定粒徑分布和顆粒在溶液中的濃度，分離出的微?？梢宰詣?dòng)用標(biāo)準(zhǔn)餾分收集器收集。

在進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，既要求教師對(duì)學(xué)生所講述的時(shí)事新聞?dòng)腥娴牧私猓莆兆钚聞?dòng)態(tài)，又要求教師能夠客觀準(zhǔn)確地進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，能夠?qū)W(xué)生進(jìn)行有效的引導(dǎo)。開展時(shí)事新聞評(píng)論活動(dòng)，要求教師平時(shí)要關(guān)注國(guó)內(nèi)外新聞、關(guān)注社會(huì)熱點(diǎn)問題，深入思考，這樣教師在回答學(xué)生的疑問時(shí)才能做到游刃有余?！敖膛c學(xué)最本質(zhì)的、最有決定意義的關(guān)系是相長(zhǎng)，即相互促進(jìn)。”[3]時(shí)事新聞評(píng)論是促進(jìn)教學(xué)相長(zhǎng)的助推器。這一教學(xué)環(huán)節(jié)使得課堂教學(xué)雙向互動(dòng)過程更加積極有效。學(xué)生能夠參與到課堂教學(xué)中來，能夠分享所見、所感、所思，使學(xué)生從被動(dòng)接受轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃?dòng)參與，不僅提升了學(xué)生的知識(shí)水平，而且鍛煉了他們的語言表達(dá)能力和組織協(xié)調(diào)能力。

單一的分離技術(shù)并不適用于各種來源的外泌體，因此研發(fā)多種不同分離技術(shù)對(duì)有效提取不同生理性能的外泌體尤為重要

。目前，已存在的外泌體分離技術(shù)包括差速離心技術(shù)、等密度梯度離心技術(shù)、尺寸排阻色譜技術(shù)、超濾技術(shù)、超速離心技術(shù)、聚合物共沉淀技術(shù)、免疫親和技術(shù)、微流控技術(shù)。不同分離技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

外泌體幾乎存在于人體內(nèi)的所有細(xì)胞中，它們既有共性又有區(qū)別，不同細(xì)胞來源的外泌體其在生理病理過程的不同階段具有不同的功能。間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在非腫瘤環(huán)境下具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)組織器官修復(fù)等功能，免疫細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)體內(nèi)免疫細(xì)胞的增殖，從而緩解炎癥或腫瘤的侵襲，而腫瘤來源的外泌體可作用于微環(huán)境，形成一個(gè)有利于腫瘤發(fā)生的微環(huán)境

。因此，了解不同細(xì)胞來源外泌體的應(yīng)用范圍和功能對(duì)科學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)化具有重要的指導(dǎo)意義（表2）。

4 外泌體的研究及應(yīng)用

利用篩選出的13對(duì)引物，對(duì)缺齒蓑蘚11個(gè)居群106份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了150個(gè)位點(diǎn)，其中148個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)。11個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率為45.95% ～ 81.08%，其中最高的是浙江溫州烏巖嶺居群，最低的是浙江金華大盤山居群，物種總多態(tài)位點(diǎn)百分率為98.67%。

4.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的研究進(jìn)展

2.2.2 超濾技術(shù) 超濾技術(shù)使用超細(xì)納米復(fù)合膜對(duì)含有不同截流分子量（molecular weight cut?off，MWCO）的生物樣品進(jìn)行分離，篩選出外泌體

。目前常用的有兩種簡(jiǎn)易的超濾裝置，第一種裝置是串聯(lián)配置微孔過濾器

；第二種裝置是序列超濾過濾器

。超濾技術(shù)可顯著縮短操作時(shí)間，不需要特殊的設(shè)備，可通過調(diào)整超濾膜孔徑大小來尋找胞外囊泡的不同子集。然而，超濾膜易堵塞影響分離效率，傳統(tǒng)方法可通過蛋白酶清洗超濾膜解決濾膜堵塞的問題，現(xiàn)階段改進(jìn)的切向流過濾技術(shù)是解決這一問題的理想方法。其次，與外泌體大小相近的納米粒子可以通過超濾膜是超濾技術(shù)的另一個(gè)缺陷，因此現(xiàn)在較為常規(guī)的使用是將超濾技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合

。

4.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體是理想的藥物載體 理想的藥物載體應(yīng)具有細(xì)胞靶向性、治療有效性及免疫耐受性?，F(xiàn)在常用的藥物載體是脂質(zhì)體，與較大的脂質(zhì)體相比，較小的脂質(zhì)體雖具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，但其藥物保留率和釋放能力會(huì)減弱，為了減少脂質(zhì)體在體內(nèi)的清除率和毒性，經(jīng)過改造后的脂質(zhì)體免疫耐受性降低。因此，脂質(zhì)體作為藥物載體存在局限性，外泌體就具備理想載體的條件：低毒性、免疫耐受、可進(jìn)入血腦屏障，并可直接作用于炎癥或腫瘤組織。并且外泌體中具有功能性的生物成分可輔助靶向部位的治療，樹突狀細(xì)胞來源外泌體膜蛋白（lysosomeassoci?ated membrane glycoprotein 2b，Lamp2b）與神經(jīng)特異性RVG 肽融合進(jìn)行改建，作為藥物靜脈注射入有阿茲海默癥的小鼠，發(fā)現(xiàn)可以靶向敲除β?分泌酶1（β?site APP cleaving enzyme 1，BACE1），改善阿茲海默癥相關(guān)癥狀

。

4.2 腫瘤細(xì)胞來源外泌體的研究進(jìn)展

4.2.1 腫瘤細(xì)胞來源外泌體可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞來源外泌體其功能與正常細(xì)胞來源外泌體有較大差異。腫瘤細(xì)胞來源外泌體可通過自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，慢性髓系白血病細(xì)胞來源外泌體中含有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1），可與白血病細(xì)胞中的TGF?β1 受體結(jié)合，激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinas?es，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和抗凋亡通路從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)

。腫瘤細(xì)胞來源外泌體還可作用于基底細(xì)胞，從而形成促癌的微環(huán)境，基底細(xì)胞來源外泌體可作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；乳腺癌來源外泌體可通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?絲/蘇氨酸激酶受體（TGF?β/SMAD）途徑誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向腫瘤相關(guān)肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

。

4.2.2 腫瘤細(xì)胞來源外泌體可引起腫瘤的耐藥性 黑色素瘤和卵巢癌來源的外泌體可輔助細(xì)胞排出藥物毒性，從而產(chǎn)生藥物耐藥性；含有miR?30a、miR?222 和miR?100?5p 的外泌體可以誘使藥物敏感性細(xì)胞通過激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）或雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）對(duì)藥物產(chǎn)生耐受；基底細(xì)胞來源外泌體也可使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，巨噬細(xì)胞來源外泌體中含有miR?365，激活胞苷脫氨酶，減少胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性

。

4.2.3 腫瘤細(xì)胞來源外泌體具有激活免疫或抑制免疫系統(tǒng)的功能 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源外泌體既有激活免疫系統(tǒng)的功能，又有抑制免疫系統(tǒng)的作用。免疫系統(tǒng)的激活通過外泌體的抗原呈遞作用，免疫抑制則通過外泌體所攜帶的配體，蛋白質(zhì)和miRNA 抑制T 細(xì)胞活性。腫瘤來源外泌體可將熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、主要組織相容性復(fù)合體?Ⅰ（major histocompatibility com?plex?Ⅰ，MHC?Ⅰ）傳輸至樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)潛在的CD8

T 細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用

。外泌體中所攜帶的抗原和MHC 為其作為抗癌疫苗的研發(fā)成為可能

。然而，腫瘤來源的外泌體可以表達(dá)TGF?β和自然殺傷細(xì)胞2 族成員D（natural killer cell family 2 member D，NKG2），從而下調(diào)NK 細(xì)胞和CD8

T 細(xì)胞表面NKG2D 的表達(dá)，降低其活性

。

汝城縣小型農(nóng)田水利重點(diǎn)縣建設(shè)項(xiàng)目于2011年通過全省公開競(jìng)爭(zhēng)遴選，以建設(shè)方案第一名、綜合得分第二的好成績(jī)被列入全國(guó)第三批小型農(nóng)田水利重點(diǎn)縣。該項(xiàng)目計(jì)劃分3年實(shí)施，發(fā)展高效節(jié)水面積6萬畝（0.4萬hm2），建設(shè)范圍涉及汝城縣的土橋鎮(zhèn)、田莊鄉(xiāng)、附城鄉(xiāng)、三星鎮(zhèn)、大坪鎮(zhèn)、井坡鄉(xiāng)等6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)54個(gè)村。項(xiàng)目建成后，將明顯改善汝城人民的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件，進(jìn)一步提高農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力，增強(qiáng)農(nóng)業(yè)抗御自然災(zāi)害能力。

第二，嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活，優(yōu)化黨內(nèi)政治生態(tài)。“嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活、凈化黨內(nèi)政治生態(tài)，是黨的建設(shè)中帶有根本性、基礎(chǔ)性的問題，關(guān)乎黨的團(tuán)結(jié)統(tǒng)一，關(guān)乎黨的生死存亡?！盵4]P37要不斷增強(qiáng)黨內(nèi)政治生活政治性、原則性、時(shí)代性、戰(zhàn)斗性，自覺抵制商品交換原則對(duì)黨內(nèi)平等同志關(guān)系與健康黨內(nèi)生活的侵蝕和污染，通過黨內(nèi)政治生態(tài)的不斷凈化和優(yōu)化來提高黨的凝聚力、創(chuàng)造力和戰(zhàn)斗力，通過匡正選人用人導(dǎo)向、淳化黨內(nèi)風(fēng)氣在全黨營(yíng)造風(fēng)清氣正、干事創(chuàng)業(yè)、爭(zhēng)先創(chuàng)優(yōu)的大氛圍、大環(huán)境和大場(chǎng)勢(shì)，為推動(dòng)全面從嚴(yán)治黨向縱深發(fā)展持續(xù)注入強(qiáng)大正能量。

4.2.4 腫瘤細(xì)胞來源外泌體可作為生物標(biāo)記物外泌體來源于血液、尿液、唾液和腦脊液，它們可作為癌癥診斷中理想的生物標(biāo)記物。腦脊液外泌體中高表達(dá)的miR?21 可作為惡性膠質(zhì)瘤發(fā)展的標(biāo)記物，并可以預(yù)估腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移

。然而，在不同的研究課題組中外泌體的提取方法不盡相同，研究缺乏一個(gè)共性的指標(biāo)，這些問題會(huì)影響臨床診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確性。

目前，IntelliScore 公司研發(fā)了ExoDx Prostate 試劑盒，通過從患者尿液中獲取外泌體進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合患者的家族史、種族、年齡、臨床指標(biāo)和前列腺癌特異性抗原（prostatic specific antigen，PSA），發(fā)現(xiàn)尿液中提取的外泌體具有高度的前列腺癌診斷靈敏性，這一試劑盒已在臨床研究中得到廣泛應(yīng)用

。

5 牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的應(yīng)用前景

相比于干細(xì)胞，外泌體具有低毒性、低免疫原性、易存儲(chǔ)、安全性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、無需考慮細(xì)胞活性、可穿透血腦屏障等優(yōu)勢(shì)。近年來，外泌體治療在再生醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物運(yùn)輸、免疫治療等領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)步，大量的文獻(xiàn)研究為其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前已有外泌體相關(guān)研究進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。截止2021 年12 月，世界范圍內(nèi)已有123 項(xiàng)正在招募的臨床研究，其中亞洲有27 項(xiàng)研究，中國(guó)有20 項(xiàng)研究（https://clinicaltrials.gov）（表3）。

不同細(xì)胞來源的外泌體其內(nèi)容物及功能不同，相同細(xì)胞不同培養(yǎng)基培養(yǎng)提取的外泌體也不相同，并且當(dāng)細(xì)胞處于不同的條件及環(huán)境時(shí)，如細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、低氧培養(yǎng)、炎癥刺激、三維培養(yǎng)都會(huì)對(duì)外泌體造成極大的影響，因此，尋找一類合適的供體細(xì)胞是外泌體治療技術(shù)成功的關(guān)鍵。目前牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞作為一類來源豐富、取材簡(jiǎn)單、不會(huì)對(duì)人體造成二次傷害、不涉及倫理問題的新型間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)得到大量科學(xué)研究者的青睞。牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞由頭顱神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育而來，具有獨(dú)特的組織特異性，其分泌的外泌體在神經(jīng)再生性疾病、牙髓牙本質(zhì)、皮膚再生、腫瘤治療、骨損傷修復(fù)等方面均已取得較好的療效。Li等

學(xué)者將牙髓干細(xì)胞來源外泌體通過鼠尾靜脈注射于腦缺血再灌注損傷的大鼠中發(fā)現(xiàn)其可抑制高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 pro?tein，HMGB1）/ Toll 樣 受 體4（Toll like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation fac?tor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor kappa?B，NF?κB）通路，達(dá)到抑制炎癥的效果，并對(duì)腦缺血再灌注損傷提供神經(jīng)保護(hù)。Ji 等

學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞來源外泌體可以抑制CD4

T 細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞，抑制IL?17 和TNF?α 的分泌，但其可以促進(jìn)CD4

T 極化成Treg，增強(qiáng)了IL?17 和TNF?α 的分泌；Zhang 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可促進(jìn)舌乳頭的修復(fù)、味蕾再生和神經(jīng)支配，為舌癌患者術(shù)后重建提供了可能。Zhang 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)牙上皮細(xì)胞來源外泌體可被牙乳頭細(xì)胞內(nèi)吞，促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞增殖和成牙分化，從而誘導(dǎo)牙髓的再生。Liu 等

學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，制備牙周膜干細(xì)胞來源外泌體的水凝膠系統(tǒng)，通過局部注射可以有效恢復(fù)牙周炎局部的骨再生。目前尚未有研究報(bào)道牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的副作用，也尚未有臨床招募相關(guān)項(xiàng)目。

因此，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞這些特性促使其具有作為提取外泌體供體細(xì)胞運(yùn)用于未來臨床轉(zhuǎn)化研究中的巨大潛能，為未來各類疾病的治療提供全新的治療模式。

6 小 結(jié)

綜上所述，不同細(xì)胞來源的外泌體已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)通路、再生醫(yī)學(xué)、癌癥生物學(xué)、免疫學(xué)、藥物運(yùn)輸?shù)妊芯款I(lǐng)域，為臨床轉(zhuǎn)化提供了大量的理論依據(jù)。表1 展示了近年來已存在的外泌體提取技術(shù)原理，并對(duì)比了每一項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)；表2 歸納了部分不同細(xì)胞來源外泌體的特征和作用；表3 列舉了部分國(guó)內(nèi)外正在招募的外泌體治療臨床研究項(xiàng)目。外泌體作為一種新的治療試劑，其功效已得到廣泛的認(rèn)可和肯定

，合適的外泌體來源選擇和日益標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體提取技術(shù)將有助于未來疾病治療的進(jìn)步。

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