萬魯芹 周慶軍 綜述 謝立信 審校

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院，青島 266071；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點實驗室一省部共建國家重點實驗室培育基地，青島 266071

糖尿病是多病因引起的以高血糖為特征的慢性疾病，其發(fā)病率逐漸升高。預(yù)測到2045年全球成人糖尿病患者總數(shù)將達到6.29億。長期高血糖可導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病角膜病變(diabetic keratopathy，DK)等眼科并發(fā)癥的發(fā)生，對視力及視功能造成嚴重影響。60%～70%的糖尿病患者會發(fā)生DK，DK通常沒有癥狀，但在眼外傷或手術(shù)后出現(xiàn)角膜上皮愈合延遲等表現(xiàn)，給臨床醫(yī)生帶來極大的挑戰(zhàn)。目前DK的發(fā)病機制尚不完全明確，可能與異常炎癥、氧化應(yīng)激及神經(jīng)損傷等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)抗炎治療可改善DK患者的角膜上皮延遲愈合及促進神經(jīng)修復(fù)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體作為機體固有免疫反應(yīng)組成部分可能在DK的發(fā)展中起促進作用。NLRP3炎癥小體活化后參與炎癥反應(yīng)，但活化失調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病等發(fā)生，并參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)展，其持續(xù)激活可引發(fā)慢性炎癥導(dǎo)致糖尿病患者傷口延遲愈合。NLRP3炎癥小體信號通路相關(guān)因子在DK中已有涉及，本文針對其與DK的研究現(xiàn)狀及前景進行綜述，以期為進一步研究DK的機制和治療提供方向。

1 DK的臨床特征和發(fā)病機制

DK臨床發(fā)病相對隱匿，多伴發(fā)角膜知覺減退、糖尿病性干眼、角膜細胞外基質(zhì)成分及角膜形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，其中形態(tài)結(jié)構(gòu)改變包括上皮細胞數(shù)量減少、增生變慢，黏附性降低；晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在上皮基底膜和內(nèi)皮細胞蓄積；內(nèi)皮細胞形態(tài)異常及基底神經(jīng)叢密度降低等。當角膜受到外傷或內(nèi)眼手術(shù)刺激后會出現(xiàn)明顯角膜病變，包括角膜上皮延遲愈合、點狀角膜炎、角膜潰瘍形成等，嚴重者可繼發(fā)角膜感染。目前DK的發(fā)病機制涉及高糖環(huán)境下基因表達異常、異常炎癥、異常代謝產(chǎn)物蓄積、氧化應(yīng)激及角膜神經(jīng)損害等過程，但具體機制尚未明確。多種機制之間存在相關(guān)性，異常代謝產(chǎn)物蓄積會誘發(fā)氧化應(yīng)激及異常炎癥，而角膜神經(jīng)損傷會導(dǎo)致角膜營養(yǎng)障礙，加重氧化應(yīng)激，異常炎癥會導(dǎo)致角膜上皮延遲愈合及神經(jīng)損傷。DK的發(fā)病機制是多因素相互作用的結(jié)果，哪種致病因素起主導(dǎo)作用尚待深入研究。

2 NLRP3炎癥小體信號通路與DK

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1前體組成的一類多蛋白復(fù)合體。在受到細胞內(nèi)特定信號刺激時，NLRP3發(fā)生寡聚化，促使有活性的白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18釋放，參與下游炎癥反應(yīng)。在正常生理情況下，NLRP3炎癥小體有感知代謝紊亂、監(jiān)督識別病原體的積極作用；在急性炎癥反應(yīng)期其可參與炎癥反應(yīng)，活化固有免疫反應(yīng)；在慢性炎癥反應(yīng)時，NLRP3炎癥小體過度活化引起細胞炎性壞死。NLRP3炎癥小體經(jīng)典活化途徑通常需啟動和激活2種信號。啟動信號是由核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)介導(dǎo)的NLRP3和細胞因子前體轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，激活信號包括外源病原相關(guān)分子模式和內(nèi)源危險相關(guān)分子模式、外源三磷酸腺苷(ATP)激活細胞表面嘌呤能受體P2X7介導(dǎo)的細胞內(nèi)K外流、細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增多、溶酶體破裂等。生理狀態(tài)下線粒體自噬可通過吞噬NLRP3炎癥小體、降解IL-1β和IL-18前體等發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用。NLRP3炎癥小體已被證實參與多種眼科疾病的發(fā)生和發(fā)展；其信號通路相關(guān)因子參與糖尿病創(chuàng)傷延遲愈合、介導(dǎo)周圍神經(jīng)病變、促進異常炎癥反應(yīng)、感受氧化應(yīng)激及異常代謝等，可能參與DK的發(fā)生和發(fā)展。

2.1 NLRP3炎癥小體與糖尿病角膜上皮延遲愈合

炎癥小體參與先天免疫反應(yīng)，對于正常皮膚傷口愈合過程至關(guān)重要。

NLRP3

基因敲除小鼠的皮膚傷口愈合較野生型慢，提示適度的炎癥反應(yīng)參與正常的傷口修復(fù)。而持續(xù)的炎癥會延遲傷口愈合。慢性低度炎癥和持久性氧化應(yīng)激狀態(tài)被認為是糖尿病并發(fā)癥發(fā)展的2個主要致病因素。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體作為代謝應(yīng)激的傳感器參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展，與NLRP3炎癥小體相關(guān)的IL-1β、ROS等均參與糖尿病的發(fā)病機制。在糖尿病發(fā)生期間，損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)的積累持續(xù)激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)持續(xù)炎癥及糖尿病創(chuàng)傷的延遲愈合。糖尿病創(chuàng)面愈合的晚期，局部巨噬細胞以促炎癥的M1型為主，可上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達，導(dǎo)致糖尿病相關(guān)的人和小鼠傷口愈合受損。因此NLRP3炎癥小體被認為在糖尿病傷口的持續(xù)炎癥中起關(guān)鍵作用，抑制其表達可縮短糖尿病皮膚傷口愈合時間。中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)通過NF-κB信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NLRP3活化，上調(diào)pro-IL-1β水平，導(dǎo)致糖尿病小鼠皮膚傷口慢性炎癥的持續(xù)存在，影響傷口愈合。P2X7受體-NLRP3炎癥小體-IL-1β通路在糖尿病皮膚傷口中高表達，上游及下游分子被阻斷均可改善傷口愈合。二甲雙胍通過調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3炎癥小體信號軸、抑制NLRP3炎癥小體活性和誘導(dǎo)促修復(fù)的M2型巨噬細胞極化來改善糖尿病傷口愈合。

角膜上皮愈合延遲是DK的典型表現(xiàn)之一，與糖尿病皮膚傷口延遲愈合有相似之處。炎癥反應(yīng)對角膜上皮創(chuàng)傷后的修復(fù)有積極意義，異常炎癥反應(yīng)則抑制傷口愈合。對角膜上皮堿燒傷模型的研究顯示，無菌角膜損傷后釋放的DAMPs激活NLRP3及下游炎性因子，阻斷NLRP3途徑可以抑制炎癥并改善角膜清晰度。DK作為糖尿病眼部并發(fā)癥之一，NF-κB、Ml型巨噬細胞和AGEs等誘導(dǎo)的異常炎癥可參與角膜上皮的延遲愈合。NF-κB被認為是炎癥和凋亡相關(guān)疾病的啟動機制。高糖環(huán)境可激活人角膜上皮細胞中NF-κB信號通路以及IL-1β的表達，加重糖尿病患者角膜組織的炎癥反應(yīng)；在糖尿病大鼠角膜組織中NF-κB高表達。研究發(fā)現(xiàn)在DK小鼠角膜組織中巨噬細胞功能異常，角膜上皮損傷后致炎癥M1型巨噬細胞比例升高，促修復(fù)的M2型巨噬細胞比例降低；促進M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化可促進糖尿病小鼠角膜上皮愈合。AGEs可以激活人髓核細胞中NLRP3炎癥小體，促進胰島及血管內(nèi)皮細胞損傷、誘發(fā)炎癥性疾病。AGEs在糖尿病大鼠角膜上皮和內(nèi)皮組織中的表達升高，可能參與糖尿病創(chuàng)面愈合延遲。

NLRP3炎癥小體與NF-κB、Ml型巨噬細胞和AGEs關(guān)系密切。NF-κB與M1型巨噬細胞均可上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達；AGEs作為內(nèi)源性和無菌危險信號可激活NLRP3炎癥小體活化，促進炎癥反應(yīng)。抑制NLRP3炎癥小體激活可以促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，AGEs通過激活NF-κB通路促進巨噬細胞向M1型方向極化。在糖尿病腎臟組織中，AGEs、NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-18及IL-1β表達均增加，吡格列酮可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來改善糖尿病腎病的組織損害。此外，糖尿病創(chuàng)面自噬水平增高，過強自噬不利于創(chuàng)面愈合，而自噬體可通過吞噬NLRP3炎癥小體、清除功能異常的線粒體等負性調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。Minns等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者、大鼠和小鼠角膜中ATP激活的P2X7受體增加，這可能與上皮組織延遲愈合相關(guān)。而P2X7受體在糖尿病皮膚傷口中高表達，可激活NLRP3炎癥小體導(dǎo)致傷口延遲愈合。NLRP3炎癥小體參與糖尿病皮膚創(chuàng)傷的延遲愈合，且與之通路相關(guān)的NF-κB、M型巨噬細胞、AGEs、IL-1β等誘導(dǎo)的異常炎癥可參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及角膜上皮的延遲愈合。基于以上研究可以推測NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與了DK角膜上皮延遲愈合的發(fā)生。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)中處于持續(xù)活化狀態(tài)，抑制其活化后可促進角膜上皮的損傷修復(fù)，且NLRP3炎癥小體參與正常角膜上皮的損傷修復(fù)。但NLRP3炎癥小體是否介導(dǎo)DK中巨噬細胞極化、自噬作為NLRP3炎癥小體的負調(diào)節(jié)機制是否參與角膜上皮創(chuàng)面愈合的調(diào)控等方面尚待進一步研究。

2.2 NLRP3炎癥小體與糖尿病角膜神經(jīng)病變

糖尿病角膜神經(jīng)病變是糖尿病周圍神經(jīng)病變的一部分。角膜神經(jīng)屬于三叉神經(jīng)在角膜組織的終末分支，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型中角膜神經(jīng)纖維分支少且細短，再生能力下降。角膜神經(jīng)損傷可導(dǎo)致角膜上皮延遲愈合、神經(jīng)營養(yǎng)性潰瘍等癥狀，是導(dǎo)致DK的原因之一。中性粒細胞與淋巴細胞比值、糖尿病病程等被認為是糖尿病周圍神經(jīng)病變的獨立危險因素，隨著年齡和病程增加，中性粒細胞水平相應(yīng)增加，引起全身炎性因子水平升高，進而導(dǎo)致神經(jīng)組織缺血、缺氧及變性。

NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與中樞及周圍神經(jīng)病變，導(dǎo)致神經(jīng)疼痛，抑制NLRP3炎癥小體后可改善神經(jīng)疼痛癥狀。在脊髓慢性壓迫性損傷小鼠模型中，miR-34c可通過直接結(jié)合3'-非翻譯區(qū)來抑制NLRP3的表達，通過抑制NLRP3介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥來延緩神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展。在坐骨神經(jīng)結(jié)扎建立的坐骨神經(jīng)損傷模型中，硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)-NLRP3炎癥小體軸介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，miR-23a可通過抑制脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞中趨化因子CXC受體4(CXCR4)，減少NLRP3炎癥小體的表達來緩解神經(jīng)疼痛。在小鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷中，NLRP3和NF-κB-p65等通路被上調(diào)，參與慢性神經(jīng)炎癥和神經(jīng)壞死。此外，脊髓星形膠質(zhì)細胞中的連接蛋白43(connexin43，Cx43)半通道參與周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)性疼痛，通過多肽5阻斷Cx43半通道可下調(diào)NLRP3炎癥小體，減輕神經(jīng)疼痛。對糖尿病神經(jīng)病變體外模型進行研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路表達增加會加速神經(jīng)元凋亡，引發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)的異常疼痛，抑制NF-κB表達后，可降低炎性細胞因子，改善疼痛癥狀。

NLRP3炎癥小體參與周圍神經(jīng)損傷與神經(jīng)疼痛涉及的TXNIP-NLRP3、Cx43-ATP-NLRP3和NF-κB-NLRP3通路。研究發(fā)現(xiàn)，ROS表達增加、Cx43半通道介導(dǎo)的ATP釋放和NF-κB活化等均可激活NLRP3炎癥小體，參與視網(wǎng)膜色素上皮細胞、神經(jīng)細胞的損傷。糖尿病周圍神經(jīng)病變與DR存在一定的相關(guān)性，且具有共同的致病危險因素。與非糖尿病周圍神經(jīng)病變相比，糖尿病周圍神經(jīng)病變患者發(fā)生DR和晚期DR的風(fēng)險增加。

目前尚無NLRP3炎癥小體在糖尿病角膜神經(jīng)病變中的直接相關(guān)研究，但NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與中樞及周圍神經(jīng)病變，且在糖尿病神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起作用。糖尿病患者角膜神經(jīng)支配的病理改變是糖尿病神經(jīng)病變的重要早期指標，角膜敏感性降低與糖尿病持續(xù)時間以及神經(jīng)病變的嚴重程度密切相關(guān)。在DK中抗炎藥物及神經(jīng)生長因子治療可改善炎癥反應(yīng)，促進神經(jīng)纖維再生，提示炎癥因素在角膜神經(jīng)病變中起到一定的作用，可以推測NLRP3炎癥小體相關(guān)通路參與了糖尿病角膜神經(jīng)病變的病理生理過程。Wan等研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體的抑制劑MCC950可以促進糖尿病小鼠角膜上皮損傷后神經(jīng)敏感度的恢復(fù)，并促進上皮下神經(jīng)的修復(fù)，但該研究未對角膜神經(jīng)類型進行深入研究。未來可從NLRP3炎癥小體相關(guān)通路著手，開展糖尿病角膜神經(jīng)病變的基礎(chǔ)研究。

2.3 NLRP3炎癥小體與糖尿病角膜氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是引起DK的重要機制之一，指體內(nèi)氧化過度導(dǎo)致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素之一。高糖狀態(tài)下葡萄糖可以轉(zhuǎn)化為脫氧葡萄糖酮醛，同時伴隨自身氧化，產(chǎn)生大量ROS，直接氧化和損傷細胞DNA，造成細胞凋亡。ROS同時也參與糖尿病傷口延遲愈合以及糖尿病小鼠周圍神經(jīng)病變的發(fā)生和發(fā)展。

糖尿病中單核細胞和血管內(nèi)皮細胞中增加的ROS可誘導(dǎo)NETs的形成和釋放，進而激活NLRP3炎癥小體，促進IL-1β的釋放。此外ROS增加RAGE的表達來激活NF-κB，啟動炎癥小體活化信號。ROS刺激細胞內(nèi)Ca升高，啟動NLRP3炎癥小體的激活信號來促進NLRP3炎癥小體活化。在高糖培養(yǎng)的人角膜上皮細胞中ROS及IL-1β表達增加，同時伴有AGE的累積與NF-κB信號通路的激活。AGEs導(dǎo)致細胞功能受損，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，上調(diào)細胞內(nèi)的ROS水平，而ROS能加速AGEs的形成，兩者之間形成惡性循環(huán)，參與DK的發(fā)病。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致糖尿病角膜上皮延遲愈合，與ROS激活NLRP3炎癥小體導(dǎo)致異常炎癥及神經(jīng)損傷相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2)是一種抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，在糖尿病中受損。Nrf2介導(dǎo)抗氧化防御的激活可改善小鼠糖尿病皮膚傷口愈合，說明Nrf2在機體氧化應(yīng)激過程中起保護作用。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2-NLRP3炎癥小體通路參與DR的發(fā)展，Nrf2激活后可清除NLRP3炎癥小體的激活劑ROS，下調(diào)NLRP3炎癥小體的表達及炎性因子的活化，延緩DR進展。此外，通過抑制與ROS相關(guān)的TXNIP表達，降低炎癥小體的活化，可以減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的損傷。由此可以推測ROS可能通過激活NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了DK的角膜上皮延遲愈合與神經(jīng)損傷。

此外，還有研究發(fā)現(xiàn)自噬可以調(diào)節(jié)ROS和NLRP3炎癥小體，高葡萄糖誘導(dǎo)的自噬缺乏會增加ROS的產(chǎn)生，進而激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致下游因子IL-1β分泌?？寡趸委?、自噬、ROS產(chǎn)生和NLRP3炎癥小體激活之間的聯(lián)系表明氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥參與糖尿病傷口愈合延遲。以上結(jié)果為研究NLRP3炎癥小體在糖尿病角膜上皮延遲愈合及神經(jīng)病變中的作用提供了參考方向。

3 結(jié)語和展望

綜上所述，NLRP3炎癥小體的激活是糖尿病傷口延遲愈合及周圍神經(jīng)病變的重要影響因素。糖尿病慢性并發(fā)癥中NLRP3炎癥小體激活的主要機制包括AGEs、NF-κB、ROS-TXNIP、ATP-P2X7受體等。DK作為糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要與高糖環(huán)境下周圍神經(jīng)異常、氧化應(yīng)激、異常炎癥等相關(guān)。有關(guān)DK的研究多集中在角膜上皮損傷延遲愈合、神經(jīng)敏感性下降和糖尿病性干眼的機制和治療，對于三者之間的內(nèi)在聯(lián)系及發(fā)病機制研究尚少。目前為止，NLRP3炎癥小體與DK之間的研究僅限于通路相關(guān)因子的研究，其對糖尿病角膜上皮延遲愈合、糖尿病角膜神經(jīng)病變的直接作用研究尚處于初步開展階段。已有NLRP3炎癥小體在DR、DK、糖尿病創(chuàng)傷愈合、糖尿病周圍神經(jīng)病變、干眼等疾病作用機制的研究，并且針對NLRP3炎癥小體相關(guān)通路的調(diào)控藥物、抑制劑、自噬增強劑等已在臨床或動物實驗中證實有效，為深入研究NLRP3炎癥小體信號通路在DK中的作用機制提供了理論依據(jù)。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突